RNA 恒温扩增实时荧光检测技术和结核感染 T 细胞斑点实验联合检测在结核性胸膜炎快速诊断中的应用价值

RNA 恒温扩增实时荧光检测技术和结核感染 T 细胞斑点实验联合检测在结核性胸膜炎快速诊断中的应用价值

王敏媛

陕西省结核病防治院 陕西 西安 710100

摘要：目的 探讨RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT-TB）与结核感染T细胞斑点实验（T-spot.TB）联合检测在结核性胸膜炎（TBP）快速诊断中的应用价值。方法 选择181例疑似结核性胸膜炎患者的胸腔积液作为研究对象，其中明确诊断的结核性胸膜炎患者的胸腔积液标本102例（TBP组）和非结核性胸膜炎患者的胸腔积液标本79例（非TBP组），采用SAT-TB及T-spot.TB方法进行检测。以临床诊断为标准，采用ROC曲线分析比较两种方法单独及联合检测，分析其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及一致性（Kappa值）。结果 SAT-TB、T-spot.TB、SAT-TB+T-spot.TB检测的敏感度分别为26.47%、84.31%和87.25%；特异度分别为100.00%、74.68%和100.00%；阳性预测值分别为100.00%、81.13%和100.00%；阴性预测值分别为51.30%、78.67%和85.87%；一致性（Kappa值）分别为0.239、0.593和0.857；ROC曲线下面积AUC分别为0.632（95%CI：0.589～0.675）、0.795（95%CI：0.735～0.855）和0.936（95%CI：0.904～0.969）。诊断价值SAT-TB+T-spot.TB高于SAT-TB及T-spot.TB（均p <0.05）。结论 SAT-TB和T-spot.TB联合检测对结核性胸膜炎患者有较好的临床诊断价值。

关键词：RNA恒温扩增实时荧光检测技术；结核感染T细胞斑点实验；结核性胸膜炎；胸腔积液；联合诊断

Application value of RNA simultaneous amplification and testing and T cell spot test combined detection in the rapid diagnosis of tuberculous pleurisy

Wang Min-Yuan

Shaanxi Provincial Tuberculosis Control Hospital (Xi’an 710100)

Abstract Objective To investigate the application value of RNA simultaneous amplification and testing (SAT-TB) and T cell spot test (T-spot.TB) combined detection in the rapid diagnosis of tuberculous pleurisy(TBP). Methods 181 samples of suspected tuberculous pleural effusion were enrolled,including 102 samples of tuberculous pleural effusion(TBP group)and 79 samples of non-tuberculous pleural effusion(non-TBP group) according to the Diagnostic Criteria for Tuberculous Pleurisy.All of the samples were tested by SAT-TB and T-spot.TB ,respectively. Compared and analyzed the rapid diagnostic value of two methods alone and combination detection by drawing ROC curve and detection efficiency. Results The sensitivity of SAT-TB, T-spot.TB and two methods combination detection were 26.47%,84.31% and 87.25%, respectively; the specificity of those three were 100.00%, 74.68% and 100.00%,respectively. The positive predictive value of two methods alone and combination detection were 100.00%,81.13% and 100.00%, respectively； the negative predictive value of those three were 51.30%,78.67% and 85.87%, respectively. The diagnostic agreement result (Kappa) of SAT-TB, T-spot.TB and SAT-TB plus T-spot.TB were 0.239,0.593 and 0.857,respectively; The areas under the ROC curve (AUCs) of those three were 0.632(95%

CI：0.589～0.675), 0.795(95%CI：0.735～0.855) and 0.936(95%CI：0.904～0.969),respectively.The diagnostic value of SAT-TB and T-spot.TB combination detection was higher than two methods alone detection(all P <0.05). Conclusions Combined detection of SAT-TB and T-spot.TB has better clinical diagnostic value for TBP patients.

Keywords RNA simultaneous amplification and testing (SAT-TB); T cell spot test (T-spot.TB); tuberculous pleurisy(TBP); pleural effusion; combined detection

结核性胸膜炎（tuberculous pleurisy, TBP）是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis,MTB）或其自溶、代谢产物通过直接蔓延、血行播散、淋巴道播散三种途径侵犯人体胸膜^[1]而引起的胸膜炎症，渗出性胸腔积液是其常见的临床症状，发病率仅次于肺结核和淋巴结核，是临床上常见的肺外结核疾病^[2]。由于TBP发病较为隐匿，缺乏特异性的临床表现，通常诊断需要结合临床、影像、实验室检验等多项指标综合考虑，有时需要诊断性治疗和随访^[3]；加之，结核性胸腔积液与恶性胸腔积液不易区分，所以TBP的临床确诊较为困难且极易发生误诊和漏诊。近年来，随着分子生物学及免疫学实验室检测方法的不断发展，RNA恒温扩增实时荧光检测技术（SAT-TB）及结核感染T细胞斑点实验（T cell spot test, T-spot.TB）已广泛应用于临床，对TBP的辅助诊断价值逐渐受到临床重视。本文通过回顾性研究分析181例患者胸腔积液标本SAT-TB及T-spot.TB的检测结果，探究两者联合检测在TBP诊断中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018年9月至2019年12月在本院住院的疑似TBP患者胸腔积液标本181例（男109例，女72例，年龄18～82岁，平均年龄35.62±16.36岁）为研究对象，其中明确诊断的TBP患者的胸腔积液标本102例为TBP组（男60例，女42例，年龄18～82岁，平均年龄35.36±16.64岁 ），和非TBP患者的胸腔积液标本79例为非TBP组（包括恶性胸腔积液30例、肺炎旁胸腔积液35例、糖尿病8例、心功能不全4例及肝硬化2例； 男49例，女30例，年龄19～74岁，平均年龄35.66±16.46岁）。

纳入标准：（1）TBP组：①有结核病临床症状；②胸腔积液检测抗酸杆菌阳性和（或）MTB培养阳性和（或）经穿刺活检发现并能排除其他原因所致的肉芽肿性胸膜炎；③符合渗出性胸腔积液诊断标准，经抗结核治疗，临床症状缓解、胸腔积液吸收；（2）非TBP组：①有发热、咳嗽、咳痰和胸痛等临床症状，影像学检查提示为肺部渗出影，经抗生素治疗后胸腔积液明显吸收；②胸腔积液病理活检或脱落细胞学检查确诊为肿瘤细胞；③明确原发病因，且排除结核感染；（3）年龄≥18岁；（4）资料完整；（5）知情同意。

排除标准：（1）患者入院前半年内，患胸外伤和（或）接受过有创性胸腔检查治疗；（2）既往接受过抗结核治疗；（3）妊娠期或哺乳期女性；（4）有精神疾病或认知障碍。

1.2 试剂与仪器

1. SAT-TB检测试剂盒：上海仁度生物科技有限公司

（2）SAT-TB检测：上海宏石医疗科技有限公司生产的9GP型PCR扩增仪

（3）T-spot.TB检测试剂盒：牛津免疫技术有限公司

（4）T-spot.TB检测:严格按照试剂盒说明书操作

1.3 检测方法与判断标准

（1）SAT-TB检测方法：取1ml待测胸腔积液标本加入1.5mlEP管中，12000rpm离心5min，弃上清；加入1ml无菌生理盐水重悬洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；加入50μl稀释液，充分振荡混匀，即为待测样本；将待测样本及阴性和阳性对照放入功率200W的超声破碎仪中超声破碎15min；取2μl破碎后的样本加入含30μl扩增检测液的微量反应管中，置于干热恒温仪中，60℃、10min，42℃、5min，在42℃下加入SAT酶；最后放入9GP型PCR扩增仪进行扩增。结果判断：样本曲线和阈值线交点的横坐标读数（Ct）<40，则判断为阳性结果；Ct值≥40或无数值，则判断为阴性结果。

（2）T-spot.TB检测方法：采集患者使用肝素（每100ml胸腔积液加2500IU肝素0.4ml）抗凝的胸腔积液50ml，通过离心提取胸水单个核细胞（PEMCs），洗涤后进行细胞计数，将细胞悬液浓度调整为2.5×10

⁶/ml；每份样本4个检测孔，按顺序加入阴性对照（AIM-V）、抗原A、抗原B及阳性对照（PHA）各50μl后，每孔再加入100μl细胞悬液，标注时间，于37℃±1℃、5%CO₂培养箱内孵育16-20h；效应T淋巴细胞释放细胞因子与反应孔中预包被的抗体结合，PBS液洗板5次，加入酶标二抗，于2～8℃孵育1h；PBS液洗板5次，加入底物显色液室温避光孵育7min，加蒸馏水终止反应；干燥后显微镜计数每个反应孔内的斑点数。1个斑点代表1个效应T淋巴细胞。检测结果有效的判断标准：实验设有阴性对照、以植物血凝素（PHA）作为刺激源的阳性对照以及以ESAT-6和CFP10作为刺激源的两个实验孔。阴性对照孔斑点数小于10个而阳性质控对照孔斑点数超过20个。结果判断：①阴性对照孔斑点数为0-5个，且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（阴性对照孔斑点数）≥6，则结果判断为阳性；②阴性对照孔斑点数为6-10个，且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（阴性对照孔斑点数），则结果判断为阳性；③如果上述标准不符合，且阳性对照孔正常时，则结果判断为阴性；④阴性对照孔斑点数超过10个或当阳性质控对照孔斑点数少于20个，则检测结果不确定，需复查。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行数据统计学分析处理。计量资料以均数±标准差（ ）表示，组间比较使用t检验；计数资料以例数（%）表示；诊断结果一致性使用Kappa检验；以P<0.05表示差异有统计学意义。使用MedCalc软件绘制ROC曲线并评估两种检测方法联合检测的诊断价值。

相关计算公式：敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%；阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%。

2 结果

2.1 基本情况

根据临床诊断结果分为两组，即TBP组102例和非TBP组79例，两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P >0.05），具有可对比性（见表1）。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两种检测方法单独及联合检测对TBP的诊断效能比较

以临床诊断为标准，SAT-TB、T-spot.TB、SAT-TB+T-spot.TB（联合检测）检测的敏感度分别为26.47%、84.31%和87.25%；特异度分别为100.00%、74.68%和100.00%；阳性预测值分别为100.00%、81.13%和100.00%；阴性预测值分别为51.30%、78.67%和85.87%；一致性（Kappa值）分别为0.239、0.593和0.857。（见表2）。

表2 不同检测方法对TBP的诊断效能比较

2.3 两种检测方法单独及联合检测对TBP的诊断价值比较

SAT-TB检测、T-spot.TB检测及SAT-TB+T-spot.TB检测的ROC曲线下面积AUC分别为0.632（95%CI：0.589～0.675）、0.795（95%CI：0.735～0.855）和0.936（95%CI：0.904～0.969）。SAT-TB+T-spot.TB检测的AUC与SAT-TB检测的AUC（z=12.512，p<0.0001）及T-spot.TB检测的AUC（z=5.432，p<0.0001）比较，差异具有统计学意义（见图1）。

图1 两种检测方法单独及联合检测对TBP诊断的ROC曲线

3 讨论

TBP属于第五种类型的结核病^[4]，患者早期表现为胸腔充血、水肿及少量纤维蛋白渗出，如果治疗不及时，渗出的纤维蛋白逐渐增多、发展为纤维组织，从而使胸膜增厚，严重者甚至会丧失肺功能^[5]。因此，早发现、早诊断、早治疗对于TBP患者而言显得尤为重要。目前，临床确诊TBP的方法主要有胸腔积液MTB培养和胸膜病理检查。MTB培养虽然是结核病诊断的“金标准”，但由于操作繁琐、对实验室条件要求较高、培养时间长、检出阳性率低，对TBP的早期临床诊断实用价值不高；胸膜活检、组织病理学检查虽阳性率高于传统检查方法，但属于有创操作，有很多禁忌症^[6]（如心肺功能障碍、出凝血机制异常、认知障碍等）、易引发严重的并发症^[7]且对医疗技术水平要求高，难以在基层医院开展，更不适用于疾病的初筛。现阶段，用于TBP辅助检测的单一检测方法诊断价值不同、各具优缺点，为提高诊断效率、减少误诊与漏诊率，寻找快速、操作简单、风险小、高效的联合检测方法具有重要意义。

分子生物学检测方法因具有检测时间短、特异性高、敏感性好、不易受人为因素影响等优点，而成为结核病实验室快速检测手段之一。SAT-TB检测方法是在TMA(transcription mediated amplification)恒温扩增技术基础上发展起来的一项新的核酸检测技术；具有对实验仪器要求低，实验过程规范，能有效避免实验过程中的污染问题（RNA极易在环境中降解），可快速获得检测结果(2h内)，结果准确性高等优点，可作为疾病活动性及药物疗效的监测指标；其原理是以MTB的16SrRNA为靶标^[8]，通过设计特异性的MTB核糖体RNA扩增引物及优化探针技术，使用MMLV反转录酶及具有极高转录活性的T7RNA多聚酶同步实现RNA恒温扩增和实时荧光检测^[9]。本研究中，SAT-TB检测敏感度和特异度分别为26.47%和100.00%，可能由于RNA只在活菌中存在，对于死菌，RNA裂解、检测不出结果，故其检测敏感度较低^[10]。

TBP以Th1型细胞免疫为主，T-spot.TB检测方法结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（ELISA），利用结核特异抗原（ESAT-6、CFP10）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断该受试者是否感染结核分枝杆菌（现症感染）的新方法，是目前公认的最灵敏的抗原特异性T细胞的体外检测技术。与结核分枝杆菌分离培养、结核菌素试验（PPD）等传统检测方法比较，T-spot.TB检测操作简单，一般48h报告检测结果，结果可靠，不受患者性别、年龄、卡介苗接种和机体免疫状态等影响，有利于患者早期诊断^[11]。有文献报道，由于效应T细胞有向病灶聚集的现象，胸腔积液T-spot.TB检测与外周血相比诊断结核性胸膜炎价值更高^[12]。本研究中，TBP组阳性率84.31%（86/102）高于非TBP组阳性率25.32%（20/79）;TBP组中有16例患者T-spot.TB检测结果为假阴性，可能原因有：（1）机体感染阶段不同（如在细胞免疫发生前取样）；（2）耐药及变异的结核分枝杆菌感染^[13]；（3）实验非正常操作或标本非正常保存与运输；非TBP组有20例患者T-spot.TB检测结果为假阳性，除与非正常实验原因（阳性质控液体飞溅、培养时间过长造成非特异γ-干扰素释放及内毒素污染增加干扰素分泌等）外，可能还与MTB潜伏感染^[14]有关（本组中部分患者有基础疾病）；提示T-spot.TB检测结果呈阳性时，不能立即确定为MTB感染，还需进行其他病原学检测^[15]。T-spot.TB检测方法属于免疫学检测，缺乏病原学指标^[16]，检测阳性结果不能区分MTB潜伏感染与活动性结核病，使得检测的特异度受限，故T-spot.TB检测方法不能作为单独的或起决定性作用的诊断结核病的依据。

本研究结果显示，SAT-TB与T-spot.TB联合检测敏感度、阴性预测值均高于两种方法单独检测，对于疾病的筛查有实用价值；特异度及阳性预测值可达100.00%，对疾病的确诊意义重大；与临床诊断结果一致性较高，对诊断TBP的准确度有较好的辅助作用。ROC曲线分析显示，两种方法联合检测对TBP的诊断价值优于两种方法单独检测。

综上所述，具有高特异度的SAT-TB检测方法与具有高敏感度的T-spot.TB检测方法联合检测具有省时、安全、诊断价值高等优势，对结核性胸膜炎患者的临床诊断具有重要意义。

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