新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验

新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验

郭美荣

满洲里国际旅行卫生保健中心（满洲里海关口岸门诊部） 内蒙古满洲里 021400

摘要：我国新型冠状病毒感染的肺炎病例首先在湖北省武汉市发现。新型冠状病毒属于巢病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科，基因组为单股正链 RNA。该病毒的传染源主要为新型冠状病毒感染的患者，传播途径主要为呼吸道飞沫和密切接触传播。由于是新发疾病，从新冠病毒所致感染病程到新冠病毒核酸检测技术等各个方面均缺乏大量科学数据支撑，在开展核酸检测过程中的各个环节中存在较多问题。本文就对新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验进行浅析。

关键词：新型冠状病毒；核酸临床检测；要点

1新型冠状病毒的结构特征

　 冠状病毒(命名时简写为“CoV”)是大型有包膜的正链RNA病毒，于1965年被分离出来，以其在显微镜下可见如日冕般外围的冠状特征而得名，在基因型和血清学上分为四个属，即α，β，γ和δ冠状病毒。迄今为止被发现的冠状病毒中(包括此次发现的SARS-CoV-2)，只有7种可以使人类感染。其中，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERSCoV、SARS-CoV-2都属于β属冠状病毒。

SARS-CoV-2与2003年的SARS-CoV 一样，基本结构为基因组RNA和磷酸化核衣壳蛋白(N蛋白)组成的包膜结构。包膜结构嵌合4种蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M 蛋白)和血凝素糖蛋白(HE蛋白)。N 蛋白被埋在磷脂双层中被两种不同类型的刺突蛋白覆盖，负责营养物质运输的膜蛋白(M 蛋白，属于Ⅲ型跨膜糖蛋白)和E蛋白位于病毒包膜的S蛋白之间。2020年1月6日，研究人员通过电子显微镜解析了SARS-CoV-2的显微结构：SARS-CoV-2病毒颗粒形状并不规则，呈球形或呈多形性，直径75~160nm，病毒颗粒边缘有形态近似日冕的突起，约9~12nm，这一形态与冠状病毒科一致。1月16日，上海科技大学饶子和团队率先解析了SARS-CoV-2病毒RNA 复制最关键蛋白-3CL水解酶(Mpro)的高分率晶体结构。随后，美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员利用冷冻电镜Cryo-EM 技术成功解析了SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体3.5埃的近原子分辨率结构，从生物物理及结构生物学的角度解析了SARS-CoV-2，为相关疫苗的研发工作奠定了基础。

2新冠病毒核酸检测方法

在疫情初期，最先检出新的病原体的方法是下一代测序技术/高通量测序(NGS)技术，并很快确定了新冠病毒的核酸序列。随着疫情发展，国内迅速研发出多种应用于新冠病毒核酸检测的试剂盒，绝大多数都基于实时荧光定量PCR(qPCR)技术。此外也有非常多的快速基因检测技术推出，如现场快速检验(POCT)技术、卡式荧光PCR 技术等，整个检测流程时间较短，最多可以节约3~4 h。和传统的qPCR技术相比，一体化POCT确实便携、操作简单，但是如果过于强调其"快速"的特性，其灵敏度可能受到影响，而现实的问题是传统PCR 技术都受到“假阴性”结果的挑战，在现有条件下，时间的缩短可能会进一步带来一定程度的灵敏度降低。从技术角度看，在灵敏度和特异性的平衡上，相较一些快速检测方法，目前平衡性最好的是qPCR 检测技术。从过往的重大疫情来看，无论是西非埃博拉病毒、甲型流感还是MERS，qPCR仍是各个部门主推的检测手段，目前我国已批准上市的试剂盒也均以qPCR技术为主。

目前新冠病毒核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中3段保守基因序列，即以开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)基因以及包膜蛋白(E)基因作为检测靶标，也有少数商品试剂盒同时检测刺突糖蛋白(S)基因。根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第五版)》(以下简称“实验室检测技术指南”)，在实验室要确认一个病例为阳性，需满足同一份标本中新冠病毒的ORF1ab及N 基因2个靶标特异性qPCR 检测结果均为阳性，或单靶标阳性患者重新采样/另一类型标本检测仍为单靶标阳性，故实验室针对新冠病毒的核酸检测应至少包含最为保守及特异的ORF1ab区域以及N 基因。

3新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验

3.1不同标本类型中新冠病毒的核酸检测

在最新版诊疗方案中，其确诊所提到的核酸检测标本类型不仅包含呼吸道标本及血液标本，同时在实验室检查中增加“粪便标本中可检测新型冠状病毒核酸”。实验室检测技术指南中，又将标本类型细分，呼吸道标本包含鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液;消化道标本包含粪便及肛拭子;血液标本包含全血及血清标本，并分别有相应的采集及保存要求。由于新冠病毒造成的肺炎为下呼吸道感染，对于已有症状及肺部CT改变的患者来说，下呼吸道标本(如深咳痰液、灌洗液等)为核酸检测首选，而在新冠肺炎不同病程中取上呼吸道标本(如鼻咽拭子)也能检出病毒核酸。临床上由于多数患者咳痰困难，取下呼吸道灌洗液标本操作的生物安全风险极大，故呼吸道标本以鼻咽拭子及咽拭子为主，而拭子标本采用目前的qPCR试剂盒进行检测，只有30%~50%的阳性检出率，大量的假阴性结果无法避免，必须进行多次取样检测或结合其他类型标本检查结果进行确诊。

随着对新冠病毒核酸检测的科技攻关，目前已有较多报道提出在患者的粪便标本中可检出病毒核酸，粪便标本将成为临床患者筛查的重要标本类型。

3.2不同呼吸道标本取样材料对新冠病毒核酸检测结果的影响

目前相关的诊疗方案及实验室检测技术指南并未提及用于采集鼻咽拭子及咽拭子的拭子种类，但对于呼吸道标本的病毒核酸检测来说，不同的拭子及保存管很大可能将影响核酸检测结果，但相关影响因素尚未见报道。

结语

目前实验室已开始检测新冠病毒IgM 及IgG抗体，更灵敏的核酸检测方法如数字PCR也开始应用于新冠病毒的核酸检测，部分研究团队着力于探索更加高效的新冠病毒实验室诊断模型，有望在新冠病毒的实验室检测方面大大降低假阴性率，并为更好更快地确诊新冠病毒感染者提供事实依据。

参考文献

[1]吴坤亮,王强,朱雨亭,王伟先,张丽媛,杜永国.新型冠状病毒肺炎诊治经验总结[J/OL].海南医学院学报:1-10[2020-07-07].