贵州省松桃县山地生态畜牧业发展中心 贵州省铜仁市 554100
摘要:随着养殖业的高速发展,猪的疫病发生变得更加的严重,其中以非典型、多种病毒混合方式所存在,因为病猪在发病后并未有以往病症的现象,所以在临床中发现和治疗的难度都比较大。本文主要分析PCR技术的特点,然后通过该技术在临床中分析多种猪的病症,能够进行必要的诊断与防治处理,从而可以更好的控制猪病的发展。关键词:PCR;猪病;诊断
猪病呈现出流行的态势,并且严重性逐步增大,极大的危害养猪事业的发展,也会给社会稳步发展带来一定的负面影响。猪病防治工作的重点就是要进行多种病原菌感染的遏制,从而可以达到防治的效果。因此,寻找出一种有特异性的快速诊断猪病方法有着非常重要的意义,PCR技术能够满足该要求。因此,综合进行PCR技术在猪病检测中做出防治与诊断,可以促进猪身体质量的提升。
1PCR技术的发展
PCR技术主要的优势就是扩增速度比较快,简单便捷,可以快速的实现目标基因的扩增,从而能够实现微量目的基因检测,该方式的特异性就是通过靶序列两端的寡核苷酸引物来确定。随着PCR技术水平的不断提高,传统PCR技术已经有了很大的发展,衍生出很多先进技术,如多重PCR技术、RT-PCR技术、荧光定量PCR技术,这些技术应用到动物疫病检测有着非常高的优势。
猪病诊断与防止环节中,PCR技术的合理应用主要是有如下优势:第一,操作简单;第二,特异性好;第三,扩增性能强。PCR技术应用之下可以准确的进行目的基因扩展分析,然后能够达到微量基因快速检测的效果。
PCR技术应用中,其特异性能够因为寡核苷酸产生的影响,该技术取得很大的成功,产生了比较多先进的PCR技术。比如:PCR多重技术、PCR荧光技术、RT-PCR技术,在动物疫病检测环节有着重要的价值。在进行猪病诊断与防治环节,通过PCR技术应用已经获得行业内专家的支持,能够快速发现病原菌,总结出有效的治疗方法,可以促进养殖户经济效益的提升。
2PCR技术单一病毒检测中的应用
2.1猪2型圆环病毒
技术研发人员从基因库内的2型圆环病毒ORF2的基因序列设计引物,从临床角度出发来获得该病毒基因模板,然后经过筛选之后确定最佳反应状态,然后能够获得该病毒检测PCR方法。经过一系列的试验,发现该方式对于2型圆环病毒株实施基因扩增能够获取长度为559bp的目的DNA片段,而同等状态之下发生反应也会导致猪类似病毒的检测,如猪瘟病毒、猪细小病毒等方面,在检测之后如果呈阴性,就表示这种方法有特异性;经过实验分析之后发现,通过最低浓度为PCV-2DNA含量为10.8pg的样品,效果是最好的。然后将该方式应用到临床检测中,随机选择了30个养猪场进行病料的检测,总计样本数量是81份,效果非常好,这种方式的应用效果比较好,可以给养猪场进行防疫检测和应用。还有人通过荧光定量PCR的方式进行检测圆环2型病毒,这种方式较之传统检测方式效果更好,可以特异地检测PCV-2,且与PCV-1等多种猪病毒会存在交叉反应,灵敏度可达1×102拷贝/μL,且变异系数低于5%,要比其他的常规方式有着更好的效果。
2.2猪瘟病毒
只要是发生猪瘟,就会严重危害养猪业的发展,会给养殖户造成巨大的损失。我国管理部门已经组织进行多种方式组织猪瘟传播,但是效果较差。当前有很多研究人员选择多种引物,并且通过应用了反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测猪瘟病毒的方式,从实际效果分析,扩增之后可以得到猪瘟病毒或者牛病毒性腹泻病毒的特性核算序列,然后做好病毒区分,该方式有着较高的特异性与稳定性,检测效果好且速度快。
2.3母猪繁殖障碍与呼吸综合征
该病发生之后,容易导致母猪流产、产弱仔或者幼崽死亡率较高等问题,从1987年被人类发现之后,已经在世界很多国家都发生过,我国将其作为二级传染病进行防治,由于其会给母猪繁殖产生不利影响,还会导致仔猪死亡的情况,极大的影响养猪业的发展。快速诊断能够及时的进行疾病预防,传统检测方法效果较差,浪费时间,会导致病毒传播过快,同时还会和其他病毒混淆,结果不能作为防治处理。研究人员通过采取反式聚合酶链式的方式来进行检测,从大量的研究和分析,选择确定了检测PCR方法,在具体的应用中还需要注意下面几个问题:一是陈旧样本中所提取出来的RNA极易降解,电泳过程中能够确定样品提取的RNA有明显的三条,完整性是非常好的,带形也比较清晰。二是提取的RNA及其反转录后的cDNA在零下20℃大约一周就会发生降解,所以在检测时要确保样本新鲜,以提升检测效果。
3PCR在混合感染中的应用
多重PCR技术是主要就是通过相同反应体系内中加入两种及以上的病毒引物,和传统PCR技术对比分析,多重PCR能够快速的检测两种或者以上的病原菌,检测准确率比较高,速度也非常快,敏感性较强。从猪病防治方面分析,多重病毒感染是比较容易存在的,兽医从业者经过多年经验分析总结,如果仅凭经验会导致判断准确性不足,延误治疗,而通过使用多重PCR技术能够提高检测效率和精度。当前通过分析猪瘟、流行乙脑炎、呼吸综合征病毒等方面所导致的繁殖病原进行分析,了解多重病原混合之下导致混合感染的情况,研究人员确定了5对引物来进行病毒检测,应用多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508、380和263bp,灵敏度比较高,说明多重PCR法的综合应用效果比较好,应用到该类的混合病毒感染检测有着非常好的效果。
4多重PCR技术的应用前景
多重PCR技术应用实践中,检测速度快、特异性好、灵敏度高,对于进行流行病学治理有着极为良好的效果。多重PCR方法在反应中通过进行不同种类引物的抑制反应,引物和非靶序列之下混合物进行非特异性增容,所以在明确具体的多重PCR方案过程中,首先应该确定最佳的引物设计方案,然后是进行优化反应,创造良好反应条件,然后能够避免出现非特异性扩增与假阳性的情况存在。此外,通过多重PCR方式有着非常高的灵敏度,如在硅玻基片中完成系列核酸扩增反应的多重PCR基因芯片技术、LAMP技术、实时多重PCR技术、光定量多重PCR等。但是具体使用中会有着明显的不足,只要是受到了很少量的外部DNA感染,导致出现假阳性的情况存在,并且反应之下会导致引物进行扩增,如果实验条件相对较差,就会导致出现扩增失败或者假阳性等情况的出现。
5结语
猪病发生之后会给养猪业产生致命性的打击,造成巨大的经济损失,而且目前我国的猪病发生率呈现出上升的态势,所以进行猪病诊断与防治有着非常重要的价值。当前我国的常规猪病诊断与防治的综合效果较差,而通过PCR技术能够获得非常好的效果,未来发展中还需要加强研究,以更好的促进该技术水平的提升,为猪养殖领域高速发展起到一定促进作用。
参考文献
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作者简介:张江年(1978-03-15),男,土家族,籍贯:贵州省铜仁市,当前职称:兽医师,学历:本科,研究方向:动物医学