半胱氨酸代谢关键酶基因DNA甲基化与缺血性脑卒中相关性研究

半胱氨酸代谢关键酶基因 DNA甲基化与缺血性脑卒中相关性研究

叶扬 1 王先化 2

1新疆昌吉州人民医院检验科， 831100； 2新疆昌吉州疾病预防控制中心质控科， 831100

摘要 目的：探讨半胱氨酸代谢关键酶基因表观遗传学改变与缺血性脑卒中（IS）的发病关系。方法：采用病例-对照研究设计，以动脉粥样硬化性脑梗死（ATS）患者30例为病例组，另选择同期体检健康人群30例为对照组。寻找目的基因（基因上游5kb的区域一直到第2外显子区域）的CpG岛区域，使用重亚硫酸盐修饰直接测序技术进行样本DNA甲基化检测，运用单因素或Logistic回归分析检测两组间DNA甲基化分布差异。结果：胱硫醚-β-合成酶（CBS）基因4个CpG岛同源性非常高，放弃甲基化分析；5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因有2个CpG岛；半胱氨酸合成酶（MTR）基因有1个CpG岛。两组这2个基因所有CpG岛都未发现DNA甲基化情况。结论：未发现MTHFR和MTR基因DNA甲基化改变与ATS相关。

关键词：脑卒中；DNA甲基化；同型半胱氨酸

同型半胱氨酸（Hcy）水平升高增加缺血性心脏病和卒中的风险[7]。HHcy在血管疾病中的发病机制可能与DNA甲基化有关，高Hcy导致外周血淋巴细胞DNA甲基化状态减少35%，并且增加动脉粥样硬化的风险^[1]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶、半胱氨酸合成酶（MTR）和胱硫醚-β-合成酶（CBS）是半胱氨酸代谢途径的3个关键酶。上述基因突变能导致酶活性减低和Hcy浓度改变^[2]。本研究以动脉粥样硬化血栓形成脑梗死（ATS）患者为对象，探讨MTHFR、CBS和MTR基因DNA甲基化状况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取ATS患者30例，即选择2017年1月至2020年1月在昌吉州人民医院、新疆心脑血管病医院神经内科连续入院的19~70 岁的首次发病的急性IS患者（WHO标准），时间在2 周内，病例组彼此间无血缘关系，排除继发性脑梗死、合并严重肝肾功能不全、恶性肿瘤及其他严重疾病的患者。选择同期体检的年龄性别匹配的健康人群或自愿者30例为对照组，临床表现及体格检查确定无神经系统疾病。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取受试者枸橼酸钠抗凝静脉血，使用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取模板DNA。

1.2.2 寻找目的基因（基因上游5kb的区域一直到第2外显子区域）的CpG岛区域，使用重亚硫酸盐修饰直接测序技术进行样本DNA甲基化检测，运用单因素或Logistic回归分析检测两组间DNA甲基化分布差异。。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组在性别、年龄、BMI、糖尿病病史、血脂异常、吸烟史、饮酒史上差异无统计学意义（P>0.05），病例组的高血压比例高于对照组（P=0.028）；多元Logistic回归分析显示，经调整协变量后，两组仅高血压的差异有统计学意义（P=0.035）。

2.2 甲基化分析

MTHFR、MTR、CBS三个基因CpG岛情况①MTHFR基因有2个CpG岛，两个测序反应基本可以覆盖：长度371（4920~5290），长度236（5502~5737）；②MTR基因有1个CpG岛，3个测序反应可以覆盖：长度1060（5667~6726）；③CBS基因同样是4个CpG岛，由于同源性非常高，最后放弃：长度233（4392~4624），长度685（4678~5362），长度678（5411~6088），长度878（6106~6983）。两组样本目的基因甲基化情况总结对照组和病例组的MTHFR M1片段、MTHFR M2片段、MTRM1片段、MTR M2片段、MTR M3片段等全部标本均未发现甲基化情况。

3 讨论

脑血管病领域表观遗传学的研究正逐渐引起重视。DNA甲基化是最有代表性的表观遗传学机制，在调节整体和特定基因表达、重要细胞进程的促进中起重要作用，后者比如基因组稳定、X染色体失活和基因组印迹[1]。研究表明，HHcy人群卒中风险增加5倍，主要与大动脉粥样硬化和静脉血栓形成有关，同时，HHcy 也通过其它机制影响IS发病，比如遗传学和表观遗传学方面，Hcy代谢通路上的基因变异（MTHFR、CBS、MTR和DNMT）增加HHcy人群中卒中发病风险[2]。Hcy 或Hcy代谢关键酶甲基化水平改变会导致脑对缺血性损伤的耐受性发生变化。本研究未发现MTHFR和MTR基因的甲基化改变与ATS发病风险具有相关性。有可能是由于标本的选取偏倚。甲基化研究可能选取病变组织更有意义，然而，由于在脑卒中患者中难以获得脑组织标本，而外周血标本容易获取和具有更好的实用性，因此，与大多数使用外周血细胞研究卒中流行病学一样[1]，对于表观遗传研究，外周血DNA已经包含足够信息[2]。本研究样本量小也是一个可能影响因素，但本研究只是探索性的定性研究。最后，也可能二者确实没有相关性。

参考文献

[1] Lozano R, Naghavi M, Foreman K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 [J].Lancet, 2012, 380: 2095-2128.

[2] 李刚, 赵东刚, 陈少军, 等. 血清同型半胱氨酸与血浆纤维蛋白原在脑梗死诊断中的价值[J]. 神经损伤与功能重建, 2017, 12: 463-464.