人参根和侧柏叶提取物对促进毛发生长的作用研究

人参根和侧柏叶提取物对促进毛发生长的作用研究

邵仲燕，傅容堃，王振苍

杭州心翼达医药科技有限公司，浙江杭州 310018

摘要：本研究通过水煮法对人参根和侧柏叶原料进行了天然活性成分提取，并选取成人毛囊真皮细胞对人参根和侧柏叶提取物的生物相容性进行评价，结果显示人参根和侧柏叶的天然活性成分有效促进了毛囊真皮细胞的生长和增殖。小鼠模型研究也进一步表明人参根和侧柏叶提取物能够显著促进其毛发生长。本研究表明从人参根与侧柏叶中提取的天然活性成分有可能为治疗脱发性疾病提供一种新的策略。

关键词：人参根；侧柏叶；毛囊；细胞增殖

Study on the Effect of Ginseng Root and Arborvitae Leaf Extract on Promoting Hair Growth

Shao zhongyan，Fu rongkun，Wang zhencang

(HANGZHOU XINYIDA MEDICAL TECHNOLOGY COMPANY , Hangzhou 310018, China. )

Abstract: In this study, natural active ingredients were extracted from ginseng root and arborvitae leaf by boiling method. In addition, this study also selected adult hair follicle dermal cells to evaluate the biocompatibility of the extracts from ginseng root and arborvitae leaf. The results showed that the natural active ingredients of ginseng root and arborvitae leaf effectively promote the growth and proliferation of hair follicle dermal cells. Mouse model studies also indicate that ginseng root and arborvitae leaf can promote hair growth significantly. This study show that the natural active ingredients extracted from ginseng root and arborvitae leaves may provide a new strategy for the treatment of alopecia diseases.

Key words: Ginseng root; Arborvitae leaf; Follicle; Cell proliferation

毛囊是皮肤组织的重要附属器件，是一个具有生长期、退行期和休止期三个阶段周期循环的微小器官^[1]。通过周期性的生长，毛囊细胞具有各异的生长节律和自我再生能力，而其对抗外界环境的敏感性则高度依赖于细胞所处的增殖状态^[2]。针对目前越来越常见的脱发现象，学者专家们已经对脱发疾病的防治进行了诸多研究，但效果往往并不尽如人意^[3]。

近年来，许多学者采用中医药治疗头皮脱发、斑秃等脱发性疾病，并以积累了大量的实践经验^[4,5]。人参根中的多糖是非常重要的天然药物成分，有很好的生物活性，如抗肿瘤、降血糖、免疫调节作用等^[6]。侧柏叶主要成分含有黄酮、挥发油、鞣质等，其化学成分和生物活性已有初步研究报道^[7]。本研究采用独特的提取方法获得了高纯度的人参根和侧柏叶的提取物，并研究了该提取物对毛囊真皮细胞的增殖影响规律和其对毛发生长的作用。

1材料和方法

1.1 原料和细胞来源

人参根和侧柏叶来源于市场购买。成人毛囊分离的真皮细胞和动物实验小鼠，体重18~25g，由合作医院提供。

1.2 实验仪器

培养和观察细胞需要使用的荧光显微镜，倒置显微镜，流式细胞仪，细胞培养箱，超净台，离心机等，以及动物实验所需的各种手术设备及观察仪器。

1.3 实验试剂

细胞培养液为含有生长因子（Pepro Tech），重组人胰岛素（sigma），人转铁蛋白（sigma），谷氨酰胺（sigma），青/链霉素双抗（华北制药），非必须氨基酸，胎牛血清（Hyclone）的完全培养基（1640完全培养基）。

人参根提取物和侧柏叶提取物溶液自制：称取人参根和侧柏叶重量分别为30g、3g，加入去离子水1000ml，浸泡一段时间后，在密闭的压力容器中加热1小时，收集溶液约630ml，并添加2.5倍的去离子水稀释获得最终的人参根和侧柏叶混合提取液。

1.4 毛囊真皮细胞培养

本研究选择成人毛囊真皮细胞对提取的人参根和侧柏叶提取物进行生物相容性评价。以完全培养基作为细胞培养空白对照组，在12孔板中分别加入完全培养基和含有人参根与侧柏叶混合提取物溶液（10%）的培养基，将毛囊真皮细胞悬液以 5000 个/孔加入两组培养板中进行培养，在 37 ℃、5%CO₂ 饱和湿度条件下培养，每两天更换一次培养基。采用 Zeiss cell observer活细胞工作站（Zeiss 公司）观察及记录真皮毛囊细胞在培养皿中的粘附和生长情况。

1.5 毛囊真皮细胞生长

通过MTT 法评价人参根和侧柏叶提取物的细胞毒性，以培养基空白组为对照组，每组样品均设6复孔。在每个样品孔（96孔板）中加入密度为5×10⁴ 个/孔的毛囊真皮细胞悬液，在样品槽周围的孔洞里加入等体积PBS缓冲液，维持细胞稳定的生存环境。然后将接种了细胞的培养板置于37 ℃、5% CO₂ 细胞培养箱中培养，每两天更换1次培养基。在细胞分别培养至第1、3、5、7 d时各取出一块培养板，于每个样品孔中加入10 μL MTT 溶液（5mg/mL），并在37 ℃，5% CO₂培养箱中继续孵育4 h，然后终止培养。用滴管小心吸出样品孔内的上清液后，在每孔中加入150 μL DMSO，充分震荡10 min后，使甲瓒结晶物充分溶解。用微孔板式连续波长酶标仪在波长为492 nm处测定溶解液的吸光值。

1.6 小动物毛发生长观察

本研究选择小鼠为实验动物，评价人参根和侧柏叶提取物对动物毛发生长的作用。米诺地尔是目前临床常用于治疗脱发的外用药，本实验采用米诺地尔处理作为外用促毛发生长作用实验的阳性对照。小鼠适应性饲养1周后，随机分为3 组，每组动物设立10只平行样。使用脱毛膏在实验动物背部脱除面积约为３×４cm²的毛发，皮肤呈粉红色且无破损，确认小鼠毛囊处于休止期。经脱毛处理后，在各组小鼠背部脱毛区域涂抹200μＬ的药物溶液，每天1次，连续涂抹35天。其中空白组给予75%乙醇溶液护理，阳性对照组给予5%米诺地尔溶液，人参根和侧柏叶提取物溶液组的给药剂量为200ul/天。

2实验结果与讨论

2.1细胞生长与增殖情况

本研究采用MTT比色法检测细胞的增殖过程，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，通过酶联免疫检测仪测定其在490nm波长下的吸光度值，可间接反映活细胞数量。图2显示了毛囊真皮细胞在空白培养基和含有人参根与侧柏叶提取物的培养基中增殖过程的定量实验结果。研究结果表明在细胞接种后的一个星期内，细胞在两组培养板中均开始快速的增殖，都具有很好的细胞相容性。在细胞接种1天后，两组培养板中细胞增殖情况差别不大，细胞数量比较接近。但是在第2天时，吸光度值的差别表明两体系的活细胞数量开始出现一定的差异。而在第3、4、5天时，这种差异逐渐增大，在含有人参根和侧柏叶的体系中的活细胞数量要多于空白对照组中的细胞。这表明本研究获得的人参根和侧柏叶的天然活性成分能够有效促进皮肤毛囊真皮细胞的生长和增殖。 图2 毛囊真皮细胞在1周内的增殖情况（n=10）

Fig.2 The proliferation of human hair follicle dermal cells in 7 days (n=10) (MTT measured in units of optical density at 490nm).

2.2 小鼠毛发生长情况

通过对实验动物脱毛部位皮肤及毛发生长状况进行跟踪观察，用电动刮毛刀刮取每组实验小鼠背部脱毛区域面积新生的毛发，收集以后用分析天平称重分析，研究结果如表1所示。结果发现含有人参根与侧柏叶提取物的溶液处理之后的小鼠毛发生长速度要快于空白组和阳性对照组，这极大的促进了毛发缺损部位的修复和再生速度。而且在一个月后，获取的实验组动物的新生毛发质量也显著高于空白组和阳性对照组，这表明本研究获得的人参根和侧柏叶提取物成分可以有效促进皮肤毛发的再生过程。

表1 各组实验小鼠的毛发生长情况(n=10)

Table 1 Hair growth of mice in each group (n=10)

3、结论

本研究采用水煮工艺从人参根与侧柏叶中提取的天然产物具有较好的生物活性，可以有效促进毛囊真皮细胞的生长，而且可以促进动物毛发的生长，故而有可能为治疗脱发性疾病难题提供一种新的解决方案。

参考文献：

[1] 麦跃,史春梦,屈纪富,等.皮肤组织工程中毛囊外根鞘细胞增殖能力及细胞角蛋白表达的意义[J].中国临床康复,2003,(26).3548-3549.

[2] Hara M, Kobayasi H, Iguchi M,et al. Communication network in the follicular papilla and connective tissue sheath through gap junctions in human hair follicles. [J]. Experimental Dermatology, 2003,12(3).

[3] Gutierrez Salmeron MT, Naranjo Sintes R, Castellote Caballero L, et al. Androgenetic alopecia and cardiovascular risk factors in men and women: a comparative study.[J].Journal of the American Academy of Dermatology, 2010,63(3).

[4] 范卫新，朱文元．女贞子等中药对小鼠毛囊生长周期中生长因子mRNA表达的影响。中华皮肤科杂志、2000，33(4)229～231

[5] Shen Haiyan, Cheng Hanxiao, Chen Haihua, et al. Identification of key genes induced by platelet-rich plasma in human dermal papilla cells using bioinformatics methods[J]. Molecular medicine reports,2017,15(1).

[6] Singh Priyanka, Singh Hina, Castro-Aceituno Veronica, et al. Engineering of mesoporous silica nanoparticles for release of ginsenoside CK and Rh2 to enhance their anticancer and anti-inflammatory efficacy: in vitro studies[J].Journal of nanoparticle research: An interdisciplinary forum for nanoscale science & technology,2017,19(7).

[7] Shan Mingqiu, Li Sam Fong Yau,Yu Sheng ,et al. Chemical Fingerprint and Quantitative Analysis for the Quality Evaluation of Platycladi cacumen by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled with Hierarchical Cluster Analysis[J].Journal of Chromatographic Science,2018,56(1).41-48.

1