中国人民解放军 96605部队医院 吉林通化 134001
目前大部分基层医院病理科免疫组化染色操作仍是手工操作，由于实验条件难以标准化，特别是不同孵育温度对免疫组化切片染色结果影响较大，常给诊断带来困难，甚至会引起严重的不良后果。本文介绍一种恒温水浴法，可解决不同温度对免疫组化染色结果的影响，获得满意的染色效果。
1材料与方法
1.1材料 选取我院病理科存档的常见活检组织10例（食管、胃、肠、乳腺、肺的正常组织及癌组织各2例）。Ki-67是常用的免疫标记物，染色结果比较容易量化，本文选用此标记物进行实验。所有组织均经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋。每例选有代表性蜡块1个，4um厚连续切片，每例捞片4张。Ki-67一抗及试剂盒均购自上海长岛公司。抗原修复液为0.01mol/L柠檬酸修复液（pH6.0）。
1.2方法 根据一年四季温度的不同，设立4、15、25、37℃不同的孵育温度，并根据孵育温度将切片分为4组。除孵育温度外，其它实验条件均相同，具体实验步骤：（1）组织石蜡切片常规脱蜡、水化。（2）3％过氧化氢处理10min，蒸馏水冲洗3次。（3）抗原修复：柠檬酸缓冲液在高压锅中煮开，放入切片，煮沸至气阀喷汽，关火后高压锅内静置3min，流水冲洗高压锅冷却至室温。（4）甩干玻片，阻水笔画圈，PBS覆盖浸泡，甩干滴加一抗，孵育70min，PBS冲洗3次，每次2min。（5）甩干滴加二抗，孵育30min，PBS冲洗3次，每次2min。（6）滴加DAB显色10min。（7）苏木精复染3min，分化后流水冲洗、蓝化、脱水、二甲苯透明、封固。
1.3结果判定 以细胞核DAB染色呈鲜明的深棕黄色或棕褐色判为阳性；在表达最强的区域计数500个细胞，统计Ki-67增殖指数。
2结果
本组实验结果显示：孵育温度为4℃，Ki-67增殖指数约6.3％；孵育温度为15℃，Ki-67增殖指数约8.8％；孵育温度为25℃，Ki-67增殖指数约16.9％；孵育温度为37℃，Ki-67增殖指数约20.5％。上述结果提示恒温水浴法孵育温度为37℃时Ki-67增殖指数最高，细胞核DAB着色鲜艳，背景清晰。
3讨论
基层医院病理科免疫组化实验条件参差不齐，有的没有单独的免疫组化实验室，一年四季温、湿度差较大。文献报道抗原抗体反应的最佳温度多为37℃[1，2］。恒温水浴箱可以提供稳定的温度与湿度，本组采用37℃恒温水浴法进行一抗及二抗的孵育，获得了满意的染色效果，细胞核DAB着色鲜艳，定位准确，背景清晰；能给病理诊断医师提供优质的免疫组化染色结果，值得推广。
参考文献
［1］兰淼，李艳红，朱少君，等.不同一抗孵育方法对免疫组化染色效果的对比研究［J］.陕西医学杂志，2011，40（10）：1291~1292.
［2］熊玉林，李妙君，陈赞烽，等.一抗孵育温度对Pgp、MRP1免疫组化染色的的影响［J］.诊断病理学杂志，2015，22（2）：128.
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