正交试验优化三叶青叶总酚类成分的提取工艺

正交试验优化三叶青叶总 酚类成分的提取工艺

马莹璐 1,2，徐惠龙 1，陈瑾 1，曾静 1，许文 1,2*，范世明1 *，林婧 3

1福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122； 3. 中西医结合研究院 ，福建 福州 350122

【摘要】 目的：研究三叶青叶总酚类的提取工艺。方法：回流提取法，以总酚类提取率、得膏率为评价指标，采用单因素结合正交试验设计法，优化提取工艺影响因素包括料液比、提取时间、乙醇体积分数和提取次数。结果：三叶青叶总酚类提取最佳工艺为：回流提取法，提取时间120 min，提取3次，料液比1：25，乙醇体积分数70%。结论：采用单因素结合正交试验设计法考察三叶青总酚类成分的提取工艺，获得其最佳提取工艺参数，为三叶青叶总酚类的开发利用奠定实验基础。

【关键词】 三叶青叶 正交实验 总酚类 提取

三叶青，葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)^[1]，全草均可入药，是我国使用历史悠久的中草药，畲医称之为“一粒珠”，又名金线吊葫芦，是我国独有珍稀濒危药用植物^[2]。根据古医籍记载，三叶青可祛风除湿、消肿止痛，主要用于治疗高热惊厥、肺炎、肝炎等疾病^[3]。

前期课题组实验研究发现，三叶青叶的酚类成分含量较高^[4]，并且现代药理研究表明三叶青总酚类成分具有抗肿瘤、抗氧化、治疗心血管疾病、抗炎、抗病毒、抗感染等多重药理活性^[5-7]。但是对于三叶青叶总酚类的提取工艺研究较少，故本研究以前期构建的三叶青叶中8种特征性酚类成分^[4]：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷的含量测定方法，结合总酚类含量和浸膏得率为评价指标，通过单因素结合正交试验优化三叶青叶总酚类成分的提取工艺，为提高三叶青酚类成分的开发利用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 药材 “闽选一号”三叶青叶（种植基地：三明宁化），经福建中医药大学药学院药用植物学实验室范世明高级实验师鉴定为三叶青(Tetrastigma hemsleyanum）的干燥叶，样品存放于福建中医药大学药学院标本室。经粉碎，过40目筛，备用。

1.2 试药与试剂 牡荆苷（批号：MUST-0358）、异牡荆苷（批号：MUST-0681）、异荭草苷（批号：MUST-0324）、荭草苷（批号：MUST-0323)、牡荆素鼠李糖苷（批号：MUST-0357）、隐绿原酸（批号：MUST-0024）、新绿原酸（批号：MUST-0023）、绿原酸（批号：MUST-0022）均购于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸、均为色谱纯（Merck公司），水为Milli-Q Direct 16超纯水系统制备（Millipore公司）。

1.3 仪器 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦）；CPA225D 型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-500E 台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；水浴锅（上海智城分析仪器制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1三叶青提取工艺评价指标测定

2.1.1 叶总酚类的含量测定 参考课题组前期建立的三叶青叶8种酚类测定的方法^[4]：Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6*150 mm, 2.7 μm)，以1‰甲酸水（A）与乙腈（B）为流动相，98%A (0~4 min)，98%A→90%A (4~15 min)，90%A→88%A (15~30 min)，82%A→80%A (30~51 min)，80%A→98%A (51~65 min)梯度洗脱，流速为0.4 ml/min，柱温：30℃，进样量：5.0 μL，检测波长330 nm，对照品和供试品溶液中8个成分色谱分离良好，见图1。

1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.异荭草苷；5.荭草苷；6.牡荆素鼠李糖苷；7.牡荆苷；8.异牡荆苷

图1 混合对照品（A）、提取液样品（B）色谱图

2.1.2 得膏率测定 用移液管精密吸取25 ml抽滤后的三叶青提取液，干燥至恒重，精密称重，根据提取液体积计算得膏率。

2.1.3 紫外含量测定方法 三叶青总酚类测定，根据课题组前期建立的方法^[2]，提取液经三乙胺法显色30 min后用紫外分光光度计于λ=400 nm处测定其吸光度A值。并以牡荆苷为对照品建立标准曲线，得牡荆苷浓度C（μg/ml）与吸光度A回归方程：A=0.06601C+0.00177，相关系数r²=0.999。

2.2 提取方法考察 称取三叶青叶粉末5 g，共3组（超声提取、回流提取、温浸提取），每组平行两份。按料液比（三叶青药材粉末重量：乙醇体积）1:25加入相应倍量的95%乙醇，分别回流提取1 h，60 ℃温浸提取3 h，超声提取30 min，提取液趁热抽滤，测定滤液体积，依法测定得膏率和总酚类含量，结果见表1，结果表明采用回流提取法浸膏得率最高，UV和HPLC的总酚类的含量高于温浸提取和超声提取，因此对回流提取工艺进行进一步的优化。

表1 不同提取方法对三叶青总酚类的提取结果

2.3 单因素考察三叶青提取工艺

2.3.1 料液比的考察 分别称取三叶青叶粉末5 g，按照料液比1：10，1：15，1：20，1：25，1：30，1：35加入95%乙醇，共6组，平行两份，回流提取1 h，计算得膏率及总酚类含量，结果见表2。结果选定1:15~1:25进行正交设计倍量的水平考察。

表2 不同料液比对三叶青总酚类提取结果

2.3.2 提取时间考察 分别称取三叶青叶粉末5 g，加入25倍量95%乙醇分别回流提取30、60、90、120、150 min，平行两份，计算得膏率及总酚类含量，结果见表3。结果选定正交设计的时间水平为60~120 min。

表3 不同提取时间对三叶青总酚类提取结果

2.3.3 提取溶剂乙醇体积分数考察 分别称取三叶青叶粉末5 g，分别加入25倍量水，10%、30%、50%、70%、90%乙醇提取120 min，平行两份，计算得膏率及总酚类含量，结果见表4。结果选定正交设计乙醇体积分数的水平为50%~70%。

表4 不同乙醇体积分数对三叶青总酚类提取结果

2.4 正交设计实验法优化三叶青提取工艺

分别称取三叶青粉末5 g，设置9组，每组平行2份，通过L9(3⁴)正交表设计实验方案，优选最佳提取工艺，计算得膏率及总酚类含量，结果见表5。

表5 三叶青提取工艺正交设计表

2.5 正交实验结果分析

将正交实验得膏率和总酚类含量测定结果导入正交实验统计软件中计算，获得极差R和K值，极差R分析结果表明四个影响因素中对三叶青得膏率影响最大的是B提取次数，四个影响因素从小到大依次为：A提取时间＜D乙醇体积分数＜C料液比＜B提取次数，即最佳得膏率工艺为B3C3D1A3；根据HPLC测定的总酚类提取率，影响最大的是C料液比，四个影响因素从小到大依次为：A提取时间＜D乙醇体积分数＜B提取次数＜C料液比，即8种酚类成分最佳提取率工艺为C3B3D3A3；根据UV法测定的总酚酸提取率，影响最大的是D乙醇体积百分数，从小到大依次为：A提取时间＜B提取次数＜C料液比＜D乙醇体积分数，即总酚类最佳提取率工艺为；C3D3B3A3，综合三者确定三叶青总酚类提取最优工艺为：提取时间120 min，提取3次，料液比1：25，乙醇体积分数70%。

3 讨论

三叶青叶主要成分为酚类成分，由于其提取工艺研究报道较少，本研究采用单因素结合正交设计法优化其最佳提取工艺，通过比较回流、超声、温浸提取法，回流提取法的浸膏、总酚类得率最高，进一步考察了料液比对提取酚类的影响，从1:10~1:35比较中，随着料液比的升高，总酚类提取率先逐渐升高，当达到1:25时达到最大值，而当料液比大于1:25后发现其总酚类的提取率下降；考察提取时间30~150 min，随着时间增加，总酚类提取率逐渐升高，在提取时间达到120 min时达到最大值，但是随着时间继续增加，总酚类提取率反而下降；考察乙醇体积分数从0~90%，随着乙醇浓度升高，总酚类提取率逐渐升高，当体积分数达到70%时，达到最大值，继续升高总酚类提取率降低。基于单因素筛选结果进一步开展正交设计优化，综合得膏率、总酚类提取率最终确定最佳工艺为：提取时间120 min，提取3次，料液比1：25，乙醇体积分数70%。

本文研究开展三叶青叶总酚类的提取工艺研究，采用HPLC法、UV法总酚类含量和浸膏得率为评价指标，基于单因素结合正交试验法得到三叶青叶总酚类的最佳提取工艺，为三叶青叶的酚类开发利用奠定基础。

参考文献：

[1] 许文,傅志勤,林婧,等. HPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QqQ-MS的三叶青主要成分定性与定量研究[J].中国中药杂志, 2014, 39(22): 4365-4372.

[2] 范世明,谢心月,曾繁天,等. 三叶青叶化学成分鉴定及其总黄酮含量测定研究[J].药物分析杂志, 2017, 37(8): 1481-1488.

[3] Ji T, Ji W W, Wang J, et al. A comprehensive review on traditional uses, chemical compositions, pharmacology properties and toxicology of Tetrastigma hemsleyanum [J]. Journal of ethnopharmacology, 2020, 264: 113247.

[4] 范世明,徐惠龙,谢心月,等. 三叶青叶指纹图谱研究及8种酚类成分含量测定[J]. 中国中药杂志, 2016,41(21):3975-3981.

[5] 林婧,纪明妹,黄泽豪,等. 三叶青的化学成分及其体外抗肿瘤活性研究[J].中国药学杂志, 2015,50(08):658-663.

[6] 傅志勤,黄泽豪,林婧,等.蛇附子化学成分及抗氧化活性研究[J].中草药, 2015, 46(11): 1583-1588.

[7] 范世明,黄泽豪,林婧,等.蛇附子中4种黄酮类成分的分离及含量测定[J].中药材, 2014, 37(12): 2226-2230.

1基金资助：中央本级重大增减支项目(2060302)；福建省科技厅项目(2018N0012，2018I0009)；中医药公共卫生服务补助专项(财社[2019]39号)；福建省大学生创新创业项目（202010393028）；校管科研课题-平台项目（X2019002-平台）

作者简介：马莹璐，女，在读硕士，研究方向为中药资源与质量评价

通讯作者：

许 文，男，博士，讲师，研究方向为中药药效物质基础和作用机制研究

范世明，男，硕士生导师，高级实验师，研究方向为中药资源与质量评价