缺氧对高糖培养的人视网膜上皮细胞VEGF和PEDF表达的影响

缺氧对高糖培养的人视网膜上皮细胞 VEGF和 PEDF表达的影响

1 王洁敏 通讯作者 :尹虹 2 车生英

兰州市第一人民医院 730050

【摘要】本实验选择不同浓度高糖、不同浓度高糖加上缺氧及在不同的作用时间下用半定量RT-PCR测定人视网膜上皮细胞中上皮细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）与色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF）的表达变化情况，并用ELISA法检测培养液上清中VEGF与PEDF蛋白水平，从而为氧疗在治疗糖尿病视网膜病变及其他糖尿病微血管病变寻找新的理论依据。

【关键词】缺氧；高糖培养；人视网膜上皮细胞；VEGF；PEDF

引言

近年来的流行病学资料显示，糖尿病及其血管并发症的发病率呈现出了逐年升高趋势，该病的发生严重威胁着人类的身体和心理健康。糖尿病视网膜病变作为糖尿病常见的慢性微血管并发症^[1]。对于眼部正常的糖尿病患者来讲，每年约有5%-10%的人就会出现视网膜病变。糖尿病视网膜病变发病机制复杂，尚未完全阐明。VEGF广泛分布于人和动物的眼、脑、肾、肝等多种组织和细胞中，是维持器官生长发育和组织创伤修复的重要因子^[2]。在眼部，视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、周细胞、Müller细胞等均能产生较低水平的VEGF，这对于保持眼部血管的稳定状态十分必要。PEDF在体内的广泛分布提示其具有重要的功能^[3]。研究表明，PEDF有营养神经、抑制炎症反应、抑制新生血管和调节血管通透性、抑制肿瘤生长等多种生物学效应^[4]。

1材料与方法

1.1 实验材料

细胞株：人视网膜色素上皮细胞株（HRPE D407），来自于ATCC细胞库。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

常规方法体外培养人视网膜上皮细胞，同步化后随机分为6组：①正常组：5.6 mmol/L的葡萄糖；②高糖A组：15 mmol/L葡萄糖；③高糖B组：30 mmol/L葡萄糖；④缺氧对照组：5.6 mmol/L的葡萄糖+100 μmol/L的CoCl₂培养液；⑤缺氧A组：15mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl₂培养液；⑥缺氧B组：30mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl₂培养液。

以上各组分别作用24 h，48 h后取样观察，每种条件准备3份，实验可获得3次可重复性结果。

1.2.2 细胞培养的建立

（1）细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速浸到预先准备好的37 ˚C水浴箱中，不断摇动使细胞迅速解冻并复温，移至离心管，加入10倍以上培养液，混匀后以1000 rpm/min离心5 min，用移液管吸净上清，加入含10%胎牛血清的低糖培养液，移液器吹打使细胞悬浮，以大约5×10⁴/mL的密度接种于50 mL的培养瓶中，放入37 ˚C、5% CO₂恒温培养箱中静置培养，24 h后更换培养液并观察细胞形态及数目。

（2）细胞培养：将细胞接种于含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基中，置

37 ˚C、5% CO₂恒温培养箱静置培养。每天观察细胞的形态与数目，每1-2 d换液一次，待细胞长至80%-90%融合状态时进行传代。

（3）细胞传代：吸去旧的培养液，加入培养液轻轻冲洗，用0.25%胰酶消化，室温下作用大约2 min，并同时在倒置显微镜下观察，可见大部分细胞收缩变圆，边缘清晰，细胞间隙增宽，立刻终止消化，弃消化液，加入适量含 10%胎牛血清的低糖型DMEM培养液，用弯头滴管反复吹打，使细胞脱离底板并分散细胞，制成细胞悬液，然后视细胞密度进行1: 2或1: 3接种到培养瓶中进行传代，放在37 ˚C、5% CO₂恒温培养箱中继续培养。24 h换液，之后每1-2 d换液一次，3-5 d传代一次。

（4）形态学观察：在倒置显微镜下观察细胞形态。

（5）细胞的准备：取对数期细胞进行实验。

1.3 观测指标及方法

1.3.1 RT-PCR法测定人视网膜上皮细胞VEGF与PEDF mRNA表达情况

（1）总RNA提取

（2）RT-PCR采用两步法：10 µL总RNA配制逆转录反应体系，反应总体积为20 µL，经37 ˚C 5 min，42 ˚C 60min, 70 ˚C 10min，逆转录合成cDNA，以此为模板用引物经PCR方法进行扩增，反应总体积为25 µL。内参照选取GAPDH，设计引物：PEDF上游引物：5'-TACTACTCTGGACTGGAGCC-3'，下游引物：5'-CTATGCGAGGGTTGCCAGTG-3'，扩增条件为94 ˚C 2 min，94 ˚C 60 s，55 ˚C 30 s，72 ˚C 45 s，30个循环后72 ˚C延伸7 min，目的基因400 bp。VEGF上游引物：5'-TGCTCTCTTGGGTGCACTGG-3'，下游引物：5'-TTCTCCGCTCTGAACAAGGC-3'，扩增条件为：94 ˚C 3 min，94 ˚C 60s，57 ˚C 45 s，72 ˚C 45 s，35个循环后72 ˚C延伸7min，目的基因300 bp。GAPDH上游引物：5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTATT-3'，下游引物：5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG -3'，扩增条件为：94 ˚C 2 min，94 ˚C 60 s，55 ˚C 60 s，72 ˚C 45 s，30个循环后72 ˚C延伸7 min, 目的基因200 bp。引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成，分别在各自扩增条件下进行扩增。20 g/L琼脂糖凝胶电泳50min，紫外灯下用凝胶成像系统成像，用UVI图像分析处理系统进行吸光度扫描，以目的基因片段/GAPDH片段的条带灰度值比值来表示其相对含量。

1.3.2 ELISA法检测培养液上清中VEGF与PEDF蛋白水平

取出各组细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明进行测定。于波长450 nm的酶标仪上读取各样本OD值，绘制标准曲线，以样本的OD值计算VEGF与PEDF浓度。

1.4统计学方法

各组数据以均数土标准差(x±s)表示，采用SPSS统计软件进行统计学分析。各组数据间比较采用t检验进行分析，同时采用Spearman相关分析VEGF与PEDF之间的关系。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 人视网膜上皮细胞VEGF与PEDF mRNA表达比较

人视网膜上皮细胞 VEGF mRNA和PEDF mRNA含量的表达 与正常对照组相比，高糖各组与缺氧各组的人视网膜上皮细胞细胞VEGF mRNA及PEDF mRNA的表达明显升高，并呈剂量依赖性；与缺氧对照组相比，缺氧各组的人视网膜上皮细胞细胞VEGF mRNA及PEDF mRNA的表达明显升高，并呈剂量依赖性；与高糖A、B组比较，缺氧A、B组人视网膜上皮细胞细胞VEGF mRNA及PEDF mRNA的表达升高；随着时间的延长，各组人视网膜上皮细胞细胞VEGF mRNA及PEDF mRNA含量的表达呈上升趋势。（见表1）。

表1 人视网膜上皮细胞VEGF与PEDF mRNA表达比较

图1 PEDF mRNA RT-PCR电泳图像

其中，1：正常组；2：高糖A组；3：高糖B组；

4：缺氧对照组；5：缺氧A组；6：缺氧B组

图2 VEGF mRNA RT-PCR电泳图像

其中，1：正常组；2：高糖A组；3：高糖B组；

4：缺氧对照组；5：缺氧A组；6：缺氧B组

2.2 人视网膜上皮细胞VEGF与PEDF蛋白表达情况

与正常对照组相比，高糖各组与缺氧各组的人视网膜上皮细胞细胞PEDF mRNA及蛋白含量的表达明显降低，并呈剂量依赖性；与缺氧对照组相比，缺氧各组的人视网膜上皮细胞细胞PEDF mRNA及蛋白含量的表达明显降低，并呈剂量依赖性；与高糖A、B组比较，缺氧A、B组人视网膜上皮细胞细胞PEDF mRNA及蛋白含量的表达降低；随着时间的延长，各组人视网膜上皮细胞细胞PEDF mRNA及蛋白含量的表达呈下降趋势。（见表2）。

表2 人视网膜上皮细胞VEGF与PEDF蛋白表达比较

3 讨论

PEDF是一种高效的血管生成抑制剂和神经营养保护因子，在眼内天然存在，维持眼部透明组织的无血管状态，又能抑制多种血管生成诱导因子的作用。已有动物实验证实，眼内局部注射PEDF可治疗缺血缺氧和VEGF诱导的视网膜新生血管形成，具有高效、特异、安全等特点，但全身应用，理论上可能将影响机体血管再生的调节^[5-6]。PEDF作为VEGF的拮抗剂，有望作为抗新生血管药物应用于DN的治疗。本实验结果显示，正常对照组中，正常人视网膜上皮细胞 VEGF mRNA和蛋白有弱表达，PEDF mRNA和蛋白有强表达；与正常对照组相比，缺氧对照组VEGF表达明显升高，PEDF表达下降，且呈时间依赖性；与正常对照组相比，高糖A、B各组的VEGF表达明显升高，PEDF表达明显下降，且呈剂量依赖性；与缺氧对照组相比，高糖A、B各组的VEGF表达明显升高，PEDF表达明显下降，且呈剂量依赖性；在高糖A、B各组中，随着时间的延长，VEGF表达逐渐升高，而PEDF表达逐渐减少，并随着高糖浓度的增加表达呈上升或下降趋势。

本实验结果对研究糖尿病视网膜病变患者发病机制有一定的指导意义。除了控制血糖，有效改善糖尿病患者的组织缺氧状态对防止糖尿病视网膜病变等糖尿病慢性病的发生有重要意义。有关缺氧在糖尿病慢性病中的具体作用机制比较复杂，还有待于研究。

参考文献

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第一作者，王洁敏，女，主治医师，兰州市第一人民医院内分泌科，730050。通讯作者:尹虹，男，主任医师，兰州市第一人民医院内分泌科，730050。第二作者，车生英，男，兰州市第一人民医院药剂科。