两种猪伪狂犬病血清学的检测方法比较

陈亚海 1 郭卓璋 2

1 吴川市吴阳农业农村服务中心；广东吴川； 524500 2 吴川市振文农业农村服务中心 ；广东吴川； 524500

摘 要

本论文在试验中拟采用猪伪狂犬 gE 抗体试剂盒（阻断 ELISA 方法）用来血清样本检测，随后用得出的计算结果与 LAT的结果进行比较，对照两种方法的优点及其缺点和相关性，通过两种方法的重复性，稳定性，灵敏度比较，结果表明：ELISA的灵敏度比LAT高17.25 %，特异性比LAT高56.34 %，重复性误差比LAT低0.02 %，准确性比LAT高8 %。并对吉林省5个地区（长春、舒兰、榆树、德惠、磐石）的血清样本进行 PR 抗体检测，了解 PRV 在吉林省的感染情况以及流行情，结果表明：ELISA法的各项检测结果都比较准确。

关键词：猪伪狂犬病；血清学检测方法；乳胶凝集试验； ELISA试验

猪伪狂犬病是比较普遍的一种病，由伪狂犬病毒感染引发的，是影响我们国家商品猪养殖业稳定发展的主要传染病之一。同时也是当地检疫机构监控疾病的重点。目前，我国养猪场基本免疫了假白介素基因缺失疫苗，但野生病毒的感染在临床上仍很严重。疫苗免疫是预防这种疾病的最佳方法。

1 猪伪狂犬病血清学检测方法研究进展

1.1 gB抗体检测方法

gb可以说是一种保护性抗体。由于gb抗体根本不能区分带有的是全毒的疫苗和野毒疫苗和本省带有的病毒，也不能确定gb抗体的能力和其免疫的时间还有临床的发病率和许多相关检测，所以，在商品猪感染假性狂犬病病毒的条件下，gb抗体的检测受到限制。

1.2 PCR病原检测

pcr原理作用是放大位于两个已知序列之间的dna片段，和天然dna的复制比较相似。将被放大的dna分子作为模板，一对与dna模板5'和3'的结尾互补的寡核苷酸片段为引物，根据dna的半保留复制，然后在聚合酶的作用下，依据dna模板链的延伸，就可以合成新的dna。通过此过程的不断重复可以放大目标dna片段。感染猪体内pcr（ge片段）的检测率相对较高。

1.3 血凝抑制试验

一般来说，阳性血清控制时间比较长，在红细胞完全沉积前后的5 min内测试结果较好。在判断结果时，衡量反应板倾斜45度，孔里的红细胞活动良好，不凝结颗粒在边缘的凝结抑制。96孔滴定板用pbs溶液25μl滴定。每行第一孔掉落的血清为25μl。然后用吸管不断地稀释第一个孔。然后每个孔加入4个单位的抗原25μl，振荡半分钟。结果以完全抑制的最大稀释倍数为hi值。同时有已知的阳性血清、阴性血清、无抗原血清和抗原、红血球控制。

1.4 病毒分离鉴定

病毒分离可用来鉴定假性伪狂犬病。分离病毒可以用患病猪的脑组织和扁桃体组织。除此之外，猪的鼻和咽的分泌物也能分离病毒。比如猪的肾脏转移细胞（pk-15和ibrs-2）、仓鼠肾脏转移细胞（bhk-21）或鸡胚胎成纤维细胞（cef）在其治疗以后都可以直接接种。在接种疫苗后二十四小时至七十二小时内可能发生典型的细胞病变。其第一次接种没有细胞病变，可以盲传播3代。

1.5 切片检测

组织荧光抗体检测病变动物物质，比如脑组织、扁桃体分层或冷冻切片，可直接进行免疫荧光检查^[4]。有速度快，时间短结果准确等优点。然而对于刚出生的猪，其敏感性和病毒分离的敏感性相当。

1.6 DNA探针技术

选取伪狂犬病毒的一段基因作为材料并将其进行克隆，用PCR技术为基本技术，进行基因的递增。结果相对来说有一定的准确性，而且灵敏度相对高。

1.7 中和实验

将病毒接种于单层细胞进行传代培养，用特性的抗体进行微量血清中和实验，易于判断结果，可用于大量样品的检测。

1.8 免疫荧光技术

此方法是利用荧光色素对待检抗原或抗体先进行免疫荧光标记，再进行抗原－抗体结合实验，进行荧光标记的示踪。目前，此方法被证实可直接用于检测病猪的脏器组织，其中，淋巴结和扁桃体的检出率最高。

1.9 免疫接种试验

可将分离好的病毒接种于阴性实验兔的腿部肌肉或腹腔皮下，注射2d后在注射部位可看到自咬症状，最终死亡，可确诊为PR。

1.10 酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验是用酶标记抗原和颜色反应检测是否患有疾病的方法。ELISA检测与鉴定技术是目前国内外有效鉴别天然感染猪免疫的有效方法之一。该方法相对来说对操作人员的水平要求不是很高，而且获得数据的结果快，灵敏度和特异性高，所以能用他检测很多样品。oie使用它作为首选的血清学方法来诊断病毒。1990年，为了检测prv抗体建立了斑点酶联免疫吸附试验（dot-elisa），可用于检测血清中的prv抗体，并可用于疾病的临床诊断。

1.11 乳胶凝集试验(LAT)

乳胶凝集试验（lat）以抗原和抗体特异性结合特性为基础^[5]，将聚苯乙烯乳胶颗粒涂在抗原上面，让其与血清反应。如果短时间内有明显的凝集反应，就可以判定为prv感染。

本论文用PCR检测所得结果为金标准，随后用得出的计算结果与 LAT检测的结果和ELISA检测的结果进行比较，对吉林省5个地区（长春市，舒兰市，德惠市，榆树市，磐石市）的血清样本进行 PR 抗体检测，了解 PRV 在吉林省的患病以及传播的形势和走向，为本病的检测提供资源。

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物

在长春（40份）、舒兰（40份）、德惠（40份）、榆树（40份）、磐石（40份）的5个地区的养猪场共采集了200个猪血清。血清在-80 ℃，储蓄和储备。

2.1.2 试验试剂

LAT诊断试剂盒，美国idexx公司的酶联免疫吸附试验（elisa）诊断试剂盒。

美国idexx公司prv（gpi）试剂盒；乳胶凝集（lat）诊断试剂盒；prrs链接免疫吸附试验（elisa）诊断试剂盒；小鼠红细胞；高岭土；pbs溶液等。

2.3 试验方法

2.3.1 乳胶凝集(LAT)试验检测方法

（1）取各样品（血清）、阴性血清和阳性血清和稀释液一滴，滴在玻片上。

（2）在每个样品中加入一滴乳胶抗原。用小棒混合，摇晃时间为1-2 min。

（3）结果可以在3 min到5 min内观察到。样本血清呈现出“++”或更多的凝集，结果为阳性。

2.3.2 PRRS酶联免疫吸附试验(ELISA)试验检测方法

(1)在使用过程中，样品（血清）稀释四十倍，加入100μl的酶标记板的prrs和nhc孔。样品在室温下培养30 min。

(2)用洗液清洗3至5次，将液体倒入孔中，轻拍直至滤纸干燥。

(3)将酶标准抗体100 μl加入每个孔，30min反应。用洗液冲洗3至5次。孔中的液体被倒干了。

(4)在室温下用100 μl基质(tmp)溶液处理每个孔15 min，然后在每个孔中加入100 μl以终止溶液^[7]。混合，然后用xchek软件分析。

只有当阴性对照OD650的平均值减去阳性对照OD650的平均值大于等于0.3时，测试结果才有效。prvge抗体的存在与否通过计算每个样本的s/n值来确定。如果S/n≤0.6，样本被发现对prvge呈阳性反应并感染狂犬病病毒；如果0.6﹤S/n≤0.7可疑；如果S/n﹥0.7样本对prvge抗体呈阴性反应，这表明了待检测的血清是来自注射gE基因缺失秒的养殖场。

2.3.3 灵敏度比较

用PCR法测得结果的阴阳率与LAT检测法和ELISA检测法检测结果经计算可得其灵敏度。

2.3.4 特异性比较

用PCR法测得的阴阳率与LAT和ELISA法测得的阴阳率结果经计算可得。

2.3.5 重复性比较

用LAT法和ELISA法对相同血清样品进行两次检测，判断2种检测试剂的重复性。

2.3.6 准确性比较

用PCR法测得100份患病猪，患病猪主要表现因日龄而议可导致雌猪怀孕、流产、死产、木乃伊；猪感染具有多系统衰竭综合症和高死亡率的可能性，其自身的免疫既能会遭受严重的损坏，用两种试剂对100份相同患病猪样本进行检测，比较两种检测结果。

3 试验结果

3.1 两种检测方法的特异性和灵敏度比较

共测量了200个血样，以PCR检测为金标准，PCR检测结果为阳性样本58份，阴性样本142份，阳性率为29%，酶联试剂盒检测了57个阳性样本和143个阴性样本^[17]。在LAT试剂中阳性样品数是97份，阴性样品数为103份，通过PCR，LAT，ELISA的阴阳诊断结果比较，然后计算出LAT，ELISA的特异性和敏感度，结果可知:ELISA的灵敏度和特异性都高于LAT。

3.2 两种检测试剂重复性对比

200份样品中ELISA试剂盒的两次试验的结果非常相似只有1份误差，LAT检测有7份误差。从表3-5中发现，ELISA的错误率是0.01 %；LAT的错误率是0.03 %。

3.3 两种检测试剂的准确性比较

100份患病样品中ELISA的测得的数据为98份，准确率为98 %，LAT的测得的数据为90份，准确率为90 %。

4 分析与讨论

4.1 猪伪狂犬病的症状及危害

猪伪狂犬病是比较普遍的一种病，是因伪狂犬病毒感染进而引发的，是影响我们国家商品猪养殖业稳定发展的主要传染病之一。同时也是当地检疫机构监控疾病的重点。病毒感染可导致雌猪怀孕、流产、死产、木乃伊；猪感染具有多系统衰竭综合症和高死亡率的可能性。猪是病毒的天然宿主和携带者，生病的猪和鼠都是PRV感染的主要来源，正常猪感染后，其自身的免疫既能会遭受严重的损坏，然后就会引起其他传染性疾病。极大的影响了生产的效率，给给众多养殖户带来了不可逆转的损失。

4.2 各检测方法比较

通过对比分析：（1）病毒分离鉴定的灵敏度比较低。（2）切片检测但对于育肥猪与成年猪，该法则不如病毒分离敏感。（3）DNA探针技术但此方法操作复杂，成本较高。（4）中和试验虽然可用于批量检测但整体效果低于ELISA检测法（5）免疫接种试验但此方法灵敏性不高，不易于大量样品确诊。这些方法在日常检测中效果相对LAT和ELISA较差，国内外已经研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗，灭活疫苗，基因缺失弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗，而病毒载体重组疫苗和基因疫苗尚处于实验室阶段^[14]。这就要求我们继续开发高效、廉价、快速、敏感和特定的血清学诊断方法。

4.3 ELISA和LAT的检测结果比较

经检测，两种方法ELISA检测法的灵敏度为87.93，LAT检测法的灵敏度为70.68，LAT检测法的灵敏度比ELISA检测法的低；ELISA检测法的特异性检测结果为95.77，LAT检测法的特异性检测结果为39.43，LAT的特异性比ELISA的低；ELISA测得数据的重复检测率误差为0.01，LAT检测法的重复率误差为0.03，LAT检测法的重复率误差高于ELISA检测。ELISA测得的准确率为98 %，LAT测得的准确率率为90 %，ELISA测得的准确率高于LAT所测得结果。LAT试剂盒的准确性，特异性，敏感性，都低于ELISA试剂盒，而且LAT的重复检测率误差也高于ELISA，而且相对ELISA要高出很多；而且他的准确性经测试比照，比ELISA也低许多。ELISA试剂盒的检测结果比较准确，而且灵敏度高，精准度高，但是他的价格比LAT贵许多，操作的难度系数也高，对操作人员的基本功要求也多。因此，实验室监测资金匮乏和条件比较差的城市和县，LAT可以作为基本的单元调查和筛选方法。尽管ELISA的血清学诊断方法已成功应用于PRRS血清抗体监测，但仍有一些问题有待解决。

参 考 文 献

[1]初小辉. 吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D].吉林大学,2011.

[2]杨志远，韩春华，林健，等.某规模化猪场猪伪狂犬病的诊断[J].中国畜牧兽医,2013,（12）:185-189.

[3] 刘金良. 基于DNA技术的木材树种识别研究[D].南京林业大学,2012.

[4]景广宇.猪伪狂犬的诊断方法及防治措施[J].畜禽业,2014(11):78-80

[5]莫伟强,郭伟军.伪狂犬病诊断方法研究进展及其应用情况[J].今日畜牧兽医,2015(05):33-36.

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