高效离子交换色谱柱在蛋白质分离与纯化过程中的再生体现

高效离子交换色谱柱在蛋白质分离与纯化过程中的再生体现

刘红艳

连云港润众制药有限公司 222000

摘要：在我国社会经济和科技技术飞速发展中，生物技术应用水平越来越高，并且随着市场发展提出的要求，加大了有关技术理念的探索力度。现如今，生物技术已被大量引用到蛋白质生产工作中，如发酵、基因等，但针对蛋白质的分离和纯化依旧存在较多问题。因此，本文在了解当前生物技术发展与蛋白质生产情况的基础上，结合高效离子交换色谱柱设计相关实验，并分析其实验结果。

关键词：高效；离子交换色谱柱；蛋白质；分离；纯化

0引言：蛋白质作为一种高分子化合物，具备长链特性，与其他同类化合物对比分析可知，最终的分子质量非常大，并且在溶液当中因为粘度过高而无法扩散，因此在生产制造期间很容易出现变性现象。现如今，大部分制造企业都无法对其进行正确分离和纯化。这一特征主要集中在以下几点：首先蛋白质活性强，在分离纯化过程中会受各种因素的影响发生变化；其次，物料构成也有极强的多变性，且蛋白质本身含量很低；再次，物料并没有极强的平稳性，料液当中的蛋白水解酶容易降解本就不多的蛋白质；最后，目前人类应用蛋白质的形式主要集中在医药和食品两大领域中，因此实践操作的要求极高。下面利用高效的离子交换色谱柱对蛋白质的分离纯化实验进行解析。

1.背景介绍

针对蛋白质进行色谱分离与纯化，不管是所选材料的价格还是应用时长都是现场实验研究人员需要关注的焦点。因为蛋白质的样品构成较为复杂，各类大分子和功能基因的作用特征之间存在较大差异，尤其是蛋白质在规定表面上的不可逆吸附与疏水结合，都会影响利用色谱柱进行再生实验的效果^[1]。由于这一问题很难在试验操作中正确处理，所以柱子的再生与恢复都极为困难。利用非线性色谱方式处理分离纯化工作时，因为进样量要超过常见的线性色谱，柱子必然会受到更多不可逆吸附的影响，所以如何对色谱柱进行有效再生是现如今实验探究关注的焦点。结合以往实验案例分析可知，处理色谱柱最常见的洗脱液有：第一，具有强酸或弱酸性的碱性溶液；第二，高盐溶液；第三，具备有机溶剂的缓冲溶液；第四，具有极高洗脱强度的容积；第五，含尿素溶剂；第六，表层活性剂等；第七，某些蛋白质变性剂等。需要注意的是，在操作过程中，研究人员必须要严格按照标准要求清洗色谱柱，并结合程序要求进行设计分析。同时，为了保障实验探究和操作可以达到预期要求，研究人员也可以利用具有极高稳定性的填料或含有氧化剂、反应活性强的洗脱液^[2]。本文针对蛋白质分离纯化设计的实验，选用了高效性的DEAE-5PW的离子交换色谱柱与无效的TSKgel GM-5PW的离子交换色谱柱进行再生与恢复的研究。在操作过程中，主要来处理由超载洗脱法分离蛋白质后带来的柱压上升或下降等难题。

2.实验分析

2.1设备条件

TSP高效液相色谱仪是由美国制造企业提供的，其中包含了以下组成部分：第一，P4000四元梯度洗脱泵；第二，AS3000自动进样器；第三，SCM400自动脱气机；第四，FOCUS紫外可见二极管阵列检测器。同时，需要利用TSP1000软件收集实验当中的数据，并做好色谱分析。另外，所选PHM64数字p H计是由丹麦公司设计制造的，HHS电热恒温水浴锅是选自上海医疗器械三厂制造的，还有色谱柱、TSKgel GM-5PW等都是本次实验分析所需的重要组成部分^[3]。

2.2样品试剂

所选样品试剂包含：第一，氧化钠和硫酸铵需要按照规定要求进行分析提纯；第二，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠也要按照要求实施提纯；第三，胰蛋白酶需要按照1:500 的比例获取生化试剂；第四，水是实验室二次蒸馏过的。需要注意的是，上述流动相都要经过0.45um微孔膜实施过滤，并从20g/L的乳猪胸腺获取制剂。

2.3应用方法

一方面，在配备蛋白酶溶液时，要拿适量的胰蛋白酶，并将其融入到PH值为7.1的25mmol/L的磷酸盐缓冲液当中，最终得到浓度分别为0.5%和2%的溶液；另一方面，要想让色谱柱再生，需要利用高压泵将酶溶液分别传递到所选的高效和无效的色谱柱当中，而后将柱子的两头封好，并放进能保持恒温（37°C）的水浴当中，保障处理时间达到24小时。在结束处理工作后，要先后用无盐和0.5mol/L的氯化钠和PH值为7.1的0.025mol/L磷酸盐缓冲液进行全面的浇洗，一直到柱子的压力达到稳定，且相应的分解物分别排出，基线也不再变化时才能停止。

3.结果探讨

3.1处于不同体积浓度下的酶溶液

对比分析上述实验当中200uL的0.5%酶溶液处理情况可知，色谱柱的压力持续下降，但柱子的效率并没有过多变化。而研究分析200uL的2%酶溶液处理结果可以看到，色谱柱的压力持续下降，而相应的效率也得到了提升。虽然在这一实验过程中，离子交换色谱柱的再生量很低，但在提升2%酶溶液的数量后，一般可以上升到750uL，既能保障柱效，又可以增加再生的数量。同时，在实践操作过程中，不管是样品还是设备都具有极强的稳定性和重现力。在上述条件不发生变化的基础上，可以利用超载洗脱稿容度样品来发掘柱子容量的恢复性，能保障最终实验分析结果的科学性。

3.2色谱柱与酶总量的关系

所选酶溶液的数量直接决定了色谱柱的柱压和柱效，虽然这种情况是相对来讲的，但如果超过规定条件，那么就算增加再多的酶溶液也无法得到预期的实验效果。出现这一现象的根本原因在于低物产生了影响，且酶溶液的浓度具备最佳管控范围。由此可知，要想保障这项实验的再生与恢复，必须要关注色谱柱的具体情况，以及柱效和柱压等变化，而后由此入手科学管控酶溶液的应用数量。结合近年来实验操作累积经验分析，受到生物分子的不可逆吸附特点所影响，要想让高效离子交换色谱柱在有效条件下科学分离和纯化，可以选用上述方法进行操作，以此在保障柱压和柱效的基础上，提升蛋白质的分离程度，进而达到预期实验效果^[4]。

3.3不可逆与再生

按照规定的洗脱条件，对比分析色谱分离的常规时间变化可知，蛋白质具有极强的不可逆吸附性，这对选用高效离子交换色谱柱进行再生与恢复而言，很容易因为蛋白质表层的不均衡性和复杂性，在交换过程中受其他分子的影响产生作用。由于蛋白质存在不可逆吸附性的主要原因在于色谱分离过程中，蛋白质的各个位点会和固定的表层相互结合，致使吸附—解离这一平衡自由出现过多变化，并且明显超过分子。此时，只有整改多位点的吸附性，才能降低蛋白质的不可逆吸附性，并由此科学洗脱吸附的物质，让色谱柱实现真正意义上的再生^[5]。

结语

综上所述，受蛋白质各项特质和性能的影响，在选用离子交换色谱柱实施实验分析时，必须要考虑这一内容对性能的影响，以及对柱压和柱效的限制。而结合最终实验结果分析可知，通过添加适量的蛋白酶溶液，可以全面提升色谱柱的性能。而了解以往实验分析过程可知，因为在分离时蛋白质的多位点和固定表层会彼此相互结合，而通过促进结合虽然可以增加分子之间的影响力，并也会影响色谱柱的再生和恢复。因此，在未来实验分析中，研究人员必须要重视蛋白酶溶液的重要性，并注重结合以往实验结果分析，科学规范所选溶液的数量和浓度，只有这样才能确保色谱柱的再生力。

参考文献

[1] 高凡, 王晓飞, 张博. 胶束电动色谱技术在蛋白质分离分析中的应用研究进展[J]. 分析化学, 2019, 47(06):20-28.

[2] 杜莹莹、武福军、韩浩、张亚男、刘志敏. 离子交换色谱法测定重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白纯度[J]. 药物分析杂志, 2020, v.40(08):163-166.

[3] 余谦. 转基因猪血中重组人血清白蛋白分离纯化方法研究[D]. 安徽医科大学, 2019.

[4] 郑乃仁. 多维液相色谱/质谱分析系统构建及相关理论研究[D]. 北京理工大学, 2019.

[5] 陶雪梅, 朱红霞, 高立红,等. 柱后加碱-高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定农田土中草铵膦,氨甲基膦酸和草甘膦残留[J]. 色谱, 2019, v.37(09):92-98.