中药胃肠复元膏中需氧菌总数、霉菌和酵母菌的检测

中药胃肠复元膏中 需氧菌总数、霉菌和酵母菌的 检测

周再芳 1 周在玉 2

1 、重庆市地质矿产勘查开发局川东南地质大队卫生所 400030 2 、重庆市梁平区礼让镇中心卫生院 405214

摘要：目的：建立胃肠复元膏需氧菌总数、霉菌和酵母菌的检测方法。方法：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，取10ml供试液置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂，混匀，凝固，倒置培养。同时做阳性和阴性对照试验。结果：检查用培养基及检测方法的适用性符合要求，试验组和阳性对照组均能有效检出需氧菌、霉菌和酵母菌，阴性对照未检出。结论：该检测方法可行，能有效控制产品的需氧菌、霉菌和酵母菌。

关键词：胃肠复元膏；需氧菌总数、霉菌和酵母菌。

胃肠复元膏由麸炒枳壳、太子参、大黄、蒲公英、炒莱菔子、木香、赤芍、紫苏梗、黄芪、桃仁组方而成，具有益气保元，化瘀去毒，理气通下。用于胃肠手术后腹胀，胃肠活动减弱，老年性慢性便秘，气虚腹胀等症。笔者根据《中国药典》2015年版四部对需氧菌、霉菌和酵母菌的控制要求，通过对需氧菌、霉菌和酵母菌数进行试验方法学验证和样品检测，评价市售胃肠复元膏的需氧菌和霉菌数的质量状况，现报道如下：

1、仪器与试药

CSH-222J-生化培养箱（重庆创测科技有限公司），LDZX-75KBS-立式压力蒸汽灭菌器（上海申安科学仪器有限公司）；枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104、白色念珠菌CMCC (F) 98 001、 黑曲霉CMCC(F)98 003均来自中国药品生物制品检定研究院；沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液均来自北京路桥技术有限公司；胃肠复元膏（国药准字Z20174062，规格：每瓶装100g，批号：200301、200302、200303，重庆希尔安药业有限公司）。

2、可接受的限度范围标准

需氧菌总数应不得过10³cfu/g，霉菌和酵母菌总数应不得过10²cfu/g

3、需氧菌总菌、霉菌及酵母菌总数计数方法验证结果判断

在3次独立的平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

4、需氧菌、霉菌和酵母菌测试方法适应性试验

4.1供试品溶液制备：取每批供试品各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇混匀，制成1:10的供试品溶液。

4.2计数方法适用性试验

4.2.1试验组

需氧菌总数的测定：分别取0.1ml试验菌悬液（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌）加入9.9ml （1：10）供试液中，混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu。各吸取制备好的试液1ml置10个无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置，于30～35℃倒置培养3天观察。每种菌各制备2个皿。

霉菌和酵母菌总数的测定：分别取0.1 ml试验菌悬液（白色念珠菌和黑曲霉）加入9.9ml （1：10）供试液中，混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu。各吸取制备好的试液1ml置4个无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置，于20～25℃培养5天观察。每种菌各制备2个皿。

4.2.2供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

需氧菌总数的测定：分别取0.1ml的稀释液加入9.9ml（1:10）供试液中，各吸取制备好的供试液1ml置2个无菌平皿中,立即倾注温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基培养基，混匀，待凝固后，倒置，于30～35℃培养3天观察。各制备2个皿。

霉菌和酵母菌总数的测定：分别取0.1ml的稀释液加入9.9ml（1:10）供试液中，各吸取制备好的供试液1ml置2个无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置，于20～25℃培养5天观察。各制备2个皿。

4.2.3菌液对照组：取1ml上述制备的菌液，加入相应的培养基培养。

需氧菌总数的测定： 分别取0.1 ml试验菌悬液（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌）加入9.9ml 稀释液中，混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu，各吸制备好的试液1ml置10个无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置，于30～35℃倒置培养3天观察。每种菌各制备2个皿。

霉菌和酵母菌总数的测定：分别取0.1 ml试验菌株（白色念珠菌和黑曲霉）加入9.9ml稀释液中，混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu，各吸取制备好的试液1ml置4个无菌平皿中，立即倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后，倒置，于20～25℃培养5天观察。每种菌各制备2个皿。

4.2.4阴性对照组：

取实验用的稀释液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。均不得有菌生长。

验证试验的三次平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。需氧菌总数计数方法适用性试验结果（cfu/g）和霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果（cfu/g）见表 108和表 109。

结果判定：在3次独立的平行试验中，采用平皿法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。应采用其他方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

4.2.5验证结果：用平皿法测定需氧菌的回收，三次试验结果铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均在0.5～2范围内；说明本品没有抑菌作用，可以采用平皿法进行需氧菌计数。采用平皿法测定霉菌及酵母菌的回收，三次试验结果对白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值也在0.5～2范围内；说明本品没有抑菌作用，可以采用平皿法进行霉菌和酵母菌计数。

5、胃肠复元膏样品需氧菌、霉菌和酵母菌检测

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。取上述供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂，混匀，凝固，倒置培养。对三批市售品（批号：200301，200302，200303）进行检查，检测结果显示三批市售品1g供试品中，需氧菌总数均小于100cfu；霉菌和酵母菌数均小于10cfu，微生物限度均符合规定。检测结果见表 1。

表 1数批样品微生物限度检查结果

6、讨论

在检测过程中，均按照《中国药典》2015年版四部需氧菌、霉菌和酵母菌检测方法进行试验，其方法的判断结果准确，3批市售品需氧菌、霉菌和酵母菌均符合规定，说明企业工艺控制合理，产品质量可靠。

作者简介：周再芳、本科，专业：中药学、执业中药师、药学研究及中药临床应用，电话17782392740，邮箱181796273@qq.com