广东省水文局惠州水文分局 ，广东 惠州 516003
摘 要：水利行业标准SL88-2012叶绿素测定方法对样品的采集、保存及前处理较为复杂，测定过程十分繁琐，对检测人员操作水平要求较高，广东省水文水资源监测中心惠州分中心引进一台ChloroTech121B型手持式叶绿素测定仪，并开展了手持式叶绿素测定仪法与SL88-2012方法测定叶绿素a的比对试验，统计分析了两种方法测定结果的相对偏差及特性，认为手持式叶绿素测定仪器具有操作简便、快速、稳定且无污染等优点，且与SL88-2012方法所测结果无显著性差异，可以代替水利行业标准SL88-2012。
关键词：叶绿素a；手持式叶绿素测定仪；应用；研究
1背景
藻类叶绿素a是表征水体初级生产力和藻类生物量的重要指标，测定藻类叶绿素a可了解水体的生产力和富营养化水平，是水质监测的常规项目。按照测定原理，目前的藻类叶绿素a的测定方法分为分光光度法、荧光法和高效液相色谱法。荧光法和高效液相色谱法分别具有高效、灵敏及可同时测定多种色素的优点，但这两种方法所需仪器昂贵且操作复杂，不适合应用于常规水质监测。
目前，我国水利和环保行业均制定分光光度法为标准方法，广东省水文水资源监测中心目前采用经改进后的水利行业标准SL88－2012方法[1]，即分光光度法，原方法采用人工研磨方式破碎细胞，又称研磨法，经改进后采用反复冻融法代替人工研磨步骤，简称为反复冻融—浸提法，测定结果的稳定性和可靠性有了大幅提高。
经仪器方介绍该仪器具有简捷、快速、稳定、无污染等优点。由于该仪器所使用的方法为新方法，为加强内控、提高实验室出具数据的准确性和科学性，在试用期间惠州分中心对该仪器测定法与反复冻融—浸提法之间开展比对试验，以分析其出具结果的可靠性与科学性。
2反复冻融法简介及优缺点分析
2.1 基本步骤
(1)抽滤浓缩：通过孔径为0.7μm的纤维滤膜过滤一定体积水样，将藻类收集于滤膜上；将载藻滤膜对折两次，装进小封口袋，然后放入黑色塑料袋；
(2)冻融：将装滤膜放入具塞玻璃离心管中，盖紧塞帽，置于-40℃下冰冻20min；取出放置于室温下5min,此过程反复3次。
(3)浸提：向离心管中加入10mL 丙酮（90%）溶液，盖紧塞帽剧烈摇振片刻，放置于4℃冰箱中避光浸泡4~12h备用，在浸泡过程中应再摇振2~3次。
(4)离心：将离心管于3500r/min条件下离心15min；
(5)测定：在630、647、664、750nm波长处测定离心管上清液的吸光度；
2.2注意事项
(1)由于反复动融-浸提法是利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶胀来达到破碎细胞的目的，因此抽虑后的滤膜应保留少许水分，防止藻细胞失水；
(2)对折滤膜时应将含有叶绿素的部分向内，对折时注意避光；
(3)滤膜的冰冻和融解的时间不宜太长，1次冰冻和融解的时间比例大概为20min/5min，待滤膜变软即可；
(4)在反复动融和浸提中需严格避光，防止叶绿素的光降解；
(5)样品放入离心机前需用天平称重，使用空白离心管平衡，防止损坏离心机；离心机中的样品需对称放置；
(7)使用分光光度计进行测定过程，样品尽量置于黑暗环境以减少光降解；
(8)比色时，若750nm的吸光值大于0.005，表明杂质未完全沉降，干扰过大，应放入离心机再次离心；
(9)测定完毕应立即清洗比色皿。
2.3优缺点分析
2.3.1优点
相对于传统的分光光度法，反复冻融法改进了藻类细胞壁破碎及叶绿素a的提取过程。该方法的破碎和提取原理：将载有藻类细胞的滤膜置于-40℃环境下避光冰冻，造成细胞质内形成冰粒，引起细胞质体变形致使细胞壁破裂；然后至于室温条件下避光解冻，使叶绿素等内含物溶出。考虑到反复冻融对藻类细胞的破壁率受到不同细胞种类、同种藻类不同生长状况的影响，可通过增加冻融次数和延长浸提时间来提高提取率。比较实验研究表明[2][3]，反复冻融法所测得的叶绿素a 浓度水平较研磨法至少高约30-50%
2.3.2缺点
经改进后，反复冻融—浸提法省略了用丙酮浸湿滤膜后研磨提取的步骤，因此减小了对检测人员身体健康的危害，然而，该方法操作步骤仍十分繁琐，具有对环境条件要求高（操作过程要求严格避光）、对检测人员水平要求较高、耗时长、所需辅助仪器设备较多、计算过程较为繁琐等缺点。
3手持式叶绿素测定仪简介
ChoroTech121B手持式叶绿素测定仪采用荧光光度检测技术，方便灵活的手持式设计，特别适用于野外现场的快速测定，产品采用双通道设计，可在活体叶绿素、萃取叶绿素两个参数中任意选择一个进行测量。该仪器最大测量浓度为500mg/m³，检出限为0.2mg/m³，使用试管类型为Φ8mm硼硅酸玻璃管。此外，该仪器操作简便，可以实现一键测定。本次比对试验选择活体叶绿素a测量模式，水样采集后无需加保存剂，所得结果为活体叶绿素a浓度。
4比对试验分析
2020年11月—2021年1月，惠州分中心开展了叶绿素原测定方法（反复冻融法）与手持式叶绿素测定仪测定方法比对实验。比对试验所选站点为惠州分中心2020年11月—2021年1月常规监测湖库站点，具体站点名称如表1、2、3中所示。
4.1比对原理
由于叶绿素项目没有标准物质可作为控制样，因此只能通过现场实际采集的水样进行比对监测。采用反复冻融—浸提法（SL88—2012）与手持式叶绿素测定仪分析方法对同一批水样进行叶绿素a测定，统计分析测定结果的相对偏差及特性。
4.2比对结果
本次比对试验前后共开展了3批样品的比对分析，比对试验结果及两种方法的相对偏差汇总见附1、2、3。
表1 2020年11月份叶绿素比对结果统计
序号 | 断面 | 反复冻融(μg/L) | 手持式叶绿素测定仪法(μg/L) | 相对偏差（%） |
1 | 新丰江水库 | 3.6 | 3.5 | 1.4 |
2 | 白盆珠水库 | 3.3 | 4.5 | 15.4 |
3 | 黄牛埔水库 | 16.0 | 18.2 | 6.4 |
4 | 茅輋水库 | 13.9 | 15.2 | 4.5 |
5 | 虾公岩水库 | 9.3 | 8.5 | 4.5 |
6 | 契爷石水库 | 8.6 | 7.5 | 6.8 |
7 | 鸡心石水库 | 4.8 | 3.5 | 15.7 |
8 | 联和水库 | 4.8 | 5.2 | 4.0 |
9 | 观洞水库 | 7.0 | 8.5 | 9.7 |
10 | 西湖 | 15.2 | 16.5 | 4.1 |
11 | 角洞水库 | 9.4 | 10.5 | 5.5 |
12 | 红花湖水库 | 4.0 | 3.2 | 11.1 |
13 | 七礤水库 | 4.0 | 5.2 | 13.0 |
14 | 天堂山水库 | 4.4 | 3.2 | 15.8 |
15 | 松木山水库 | 17.8 | 16.2 | 4.7 |
16 | 显岗水库 | 7.4 | 8.8 | 8.6 |
17 | 横岗水库 | 14.4 | 15.8 | 4.6 |
18 | 同沙水库 | 24.7 | 26.2 | 2.9 |
19 | 水濂山水库 | 25.8 | 23.5 | 4.7 |
20 | 风田水库 | 10.3 | 8.8 | 7.9 |
表2 2020年12月份叶绿素比对结果统计
序号 | 断面 | 反复冻融(μg/L) | 手持式叶绿素测定仪法(μg/L) | 相对偏差（%） |
1 | 新丰江水库 | 2.9 | 2.5 | 7.4 |
2 | 白盆珠水库 | 3.6 | 4.2 | 7.7 |
3 | 翁潭水库 | 4.1 | 5.3 | 12.8 |
4 | 东源大坑水库 | 8.2 | 9.5 | 7.3 |
5 | 龙川新村水库 | 10.5 | 12.2 | 7.5 |
6 | 老园水库 | 5.5 | 4.7 | 7.8 |
7 | 白溪水库 | 3.7 | 4.7 | 11.9 |
8 | 散滩水库 | 4.6 | 3.4 | 15.0 |
9 | 新坑水库 | 5.4 | 7.2 | 14.3 |
10 | 雁田水库 | 7.9 | 8.5 | 3.7 |
11 | 水东陂水库 | 5.6 | 4.2 | 14.3 |
12 | 花树下水库 | 6.2 | 4.5 | 15.9 |
13 | 黄山洞水库 | 4.0 | 3.2 | 11.1 |
14 | 稿树下水库 | 4.0 | 5.1 | 12.1 |
15 | 大坑水库 | 7.2 | 5.5 | 13.4 |
16 | 伯公坳水库 | 16.3 | 15.2 | 3.5 |
17 | 庙滩水库 | 33.2 | 32.5 | 1.1 |
18 | 招元水库 | 3.6 | 4.3 | 8.9 |
19 | 响水水库 | 8.6 | 9.5 | 5.0 |
20 | 天堂山水库 | 4.1 | 3.8 | 3.8 |
表3 2021年1月份叶绿素比对结果统计
序号 | 断面 | 反复冻融(μg/L) | 手持式叶绿素测定仪法(μg/L) | 相对偏差（%） |
1 | 白盆珠水库 | 4.8 | 5.2 | 4.0 |
2 | 黄牛埔水库 | 29.6 | 32.5 | 4.7 |
3 | 东源大坑水库 | 7.4 | 8.2 | 5.1 |
4 | 龙川新村水库 | 15.9 | 16.5 | 1.9 |
5 | 白溪水库 | 15.1 | 16.3 | 3.8 |
6 | 新坑水库 | 5.6 | 7.2 | 12.5 |
7 | 雁田水库 | 12.6 | 14.5 | 7.0 |
8 | 茅輋水库 | 22.1 | 24.5 | 5.2 |
9 | 虾公岩水库 | 13.4 | 15.1 | 6.0 |
10 | 契爷石水库 | 7.8 | 7.5 | 2.0 |
11 | 鸡心石水库 | 6.6 | 5.2 | 11.9 |
12 | 联和水库 | 4.8 | 5.5 | 6.8 |
13 | 水东陂水库 | 3.6 | 4.5 | 11.1 |
14 | 观洞水库 | 14.3 | 12.5 | 6.7 |
15 | 花树下水库 | 4.8 | 5.2 | 4.0 |
16 | 梅树下水库 | 4.0 | 4.8 | 9.1 |
17 | 沙田水库 | 4.0 | 5.5 | 15.8 |
18 | 庙滩水库 | 52.2 | 45.8 | 6.5 |
19 | 西湖 | 12.1 | 14.5 | 9.0 |
20 | 角洞水库 | 9.1 | 10.5 | 7.1 |
4.3比对试验相对偏差特性分析
根据上述三批次比对试验结果绘制两轴线—柱图1、2、3。
图1 2020年11月比对结果及相对偏差图
图2 2020年12月比对结果及相对偏差图
图3 2021年1月比对结果及相对偏差图
由图1、2、3可见，当水样叶绿素含量相对较大（>15μg/L）时，共15测次的水样两种方法的测定结果相对偏差较小，平均偏差仅为4.3%，最小相对偏差可达到1.1。当水样叶绿素含量相对较小（<15μg/L）时，共45测次的水样测定结果相对偏差较大，平均值达到9.1%。
分别统计不同叶绿素含量水样相对偏差范围、不同比对结果相对偏差范围的测次，如表4、5所示：
表4 不同叶绿素含量水样相对偏差范围统计
叶绿素含量 （μg/L） | C＜5 | 5≤C≤15 | 15＜C≤30 | 30＜C≤50 |
测次（次） | 17 | 28 | 12 | 3 |
相对偏差范围（%） | 1.4—15.9 | 2.0—15.8 | 1.9—6.4 | 1.1—6.5 |
平均相对偏差（%） | 10.8 | 8.1 | 4.4 | 4.1 |
表5 不同相对偏差测次统计
偏差S（%） | ≤5 | 5＜S≤10 | 10＜S≤20 |
测次（次） | 19 | 23 | 18 |
由表4可见，叶绿素含量越大，两种方法所得结果的相符程度越高，反之亦反。由表5可知，两种方法所得结果相对偏差较大的水样所占比重较小，大部分样品两种方法所得结果的相对偏差比较小。此外，由于原冻融法要求样品前处理过程较为复杂，在样品保存、前处理及过滤、滤膜避光、反复冻融、丙酮提取及离心分离等诸多环节均存在较多干扰因素，尤其是环境、人员操作水平均难以有效控制，容易导致叶绿素a提取不完全。而采用手持式叶绿素测定仪测定时基本不用进行样品前处理，更无需反复冻融、提取及离心分离操作，所需化学试剂、辅助仪器设备大为减少，对保护叶绿素测定人员的身体健康也具有积极意义，最重要的是整个测定过程所受人为因素干扰较少、结果重现性好，极大限度的缩短了测定所需时间，原来一批样品至少需要近2天的测定时间，而使用手持式叶绿素测定仪时在一分钟内即可获得测定结果。此外，在反复冻融—浸提法受诸多条件因素限制的前提下，对上述比对结果中出现的同一水样不同方法测定结果相对偏差较大的现象可以认为是合理的，即不能因为部分水样相对偏差较大就认为是新仪器所得结果不可靠所致。
5结论
综上所述，手持式叶绿素测定仪具有操作便捷、快速、稳定等优点，且与原冻融法所测结果无显著性差异。从两种方法测定同一水样的测定结果大小关系来看，当水体叶绿素含量较低时，手持式叶绿素测定仪法所得结果相对较大，与该法测定快速、前处理损失少不无关系，因此更具有可靠性。
参考文献：
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[2白焱、傅春燕、戴欣、潘曼曼、杨航等.]水质 叶绿素的测定 分光光度法（SL88-1012).
[3]黄伟,张梅;叶绿素提取和分离实验的改进[J];生物学通报;2003年02期.
[4]黄莹波．浮游植物叶绿素a提取方法的改进:反复冻融-浸提法[J]．中国科技信息,2012,000(010):157.
[5]黄振芳,刘波,崔莉凤．浮游植物叶绿素a测定方法比较研究[C]//2008年北京市水文科学技术研讨会.2008.
作者简介：张旭明（1981—），男，汉族，广东揭阳人，助理工程师，广东省水文局惠州水文分局水资源科，主要从事水质监测评价工作。通讯地址：广东省惠州市江北金华路98号13楼水资源科。邮编：516003。
Analysis and Research on the application of portable chlorophyll analyzer
Zhang Xuming
(Huizhou hydrological branch of Guangdong Provincial Bureau of hydrology,
Huizhou,Guangdong,516003,China)
Abstract:: the water conservancy industry standard sl88-2012 chlorophyll determination method is complex in sample collection, storage and pretreatment, and the determination process is very complicated, which requires high operation level of the detection personnel. Huizhou Branch of Guangdong Provincial Hydrological and water resources monitoring center introduced a chlotec121b handheld chlorophyll analyzer, and carried out the handheld chlorophyll analyzer method and sl88-2012 method Compared with sl88-2012 method, the relative deviation and characteristics of the two methods were statistically analyzed. It is considered that the handheld chlorophyll determination instrument has the advantages of simple operation, fast, stable and pollution-free, and there is no significant difference between the results measured by sl88-2012 method and sl88-2012 method, which can replace the water conservancy industry standard sl88-2012.
Key words: chlorophyll a; handheld chlorophyll analyzer; application; research
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