安瓿包装注射液容器密封性检验方法研究-中国期刊网

安瓿包装注射液容器密封性检验方法研究

郭磊张伊思

天津金耀药业有限公司

天津市

300457

摘要:注射剂的包装系统应能保持产品内容物完整，同时防止微生物侵入。^（^1）小容量注射液为天津金耀药业有限公司主要生产产品之一，

为保证药品持续符合安全与质量要求，使用微生物侵入方法，对容器密封性进行研究。

关键字:安瓿、注射液、包装系统密封性

一、研究项目与准备

1.1研究流程概述：以10ml安瓿包装注射液为例，使用微生物侵入方法对安瓿包装注射液的密封性进行研究。

1.2试验设备与材料

1.2.1试验设备：

表 1试验设备

设备名称	型号	厂家
生物安全柜	BSC-1100IIA2-X	济南鑫贝西生物技术有限公司
生化培养箱（铜绿）	LRH-250A	广东韶关医疗器械股份有限公司
脉动真空灭菌柜	SGLASE	山东新华医疗器械股份有限公司
普通卧式压力蒸汽灭菌器	XG1.C	山东新华医疗器械股份有限公司

1.2.2阳性安瓿瓶的制备

采用激光打孔方法，在安瓿瓶身制备名义孔径为3μm、5μm、10μm的漏孔。

表2阳性安瓿瓶信息

规格	孔径级别	数量/支	样品编号	实测孔径	激光打孔位置
10ml	3μm	32	3μm-1	3.12μm	瓶身
			3μm-2	3.41μm
			3μm-3	3.32μm
			3μm-4	3.74μm
			3μm-5	2.77μm
			3μm-6	3.06μm
			3μm-7	3.69μm
			3μm-8	2.80μm
			3μm-9	2.97μm
			3μm-10	2.47μm
	5μm	20	5μm-1	4.54μm
			5μm-2	4.56μm
			5μm-3	4.86μm
			5μm-4	4.72μm
			5μm-5	4.69μm
			5μm-6	4.88μm
			5μm-7	4.42μm
			5μm-8	4.41μm
			5μm-9	5.02μm
			5μm-10	4.95μm
	10μm	10	10μm-1	9.43μm
			10μm-2	8.96μm
			10μm-3	8.69μm
			10μm-4	11.10μm
			10μm-5	10.14μm
			10μm-6	9.98μm
			10μm-7	11.13μm
			10μm-8	9.47μm
			10μm-9	9.35μm
			10μm-10	10.28μm

1.2.3试验用培养基：

试验中所用的培养基均须经过灵敏度试验，培养基和试液均须经过高压蒸汽121℃灭菌15分钟，并且应保证在试验使用过程中都在灭菌的效期之内，如超出不再使用。

表3培养基信息

培养基及缓冲液名称	批号	生产厂家
胰酪大豆胨液体培养基	1908142	北京三药科技开发公司

1.2.4试验用菌种

表4试验用菌种

菌种名称	菌种批号	来源
铜绿假单胞菌	CMCC(B)10 104	中国食品药品检定研究院

二、试验过程与试验结果

2.1样品制备

取正常样品包材90瓶，标记为A组，取微生物侵入试验使用的3μm、5μm、10μm阳性包材各10瓶，标记为B组，手动灌装10ml胰酪大豆胨液体培养基，熔封。

表5微生物侵入法样品序号记录

A组	1	2	3	4	5
	6	7	8	9	10
	11	12	13	14	15
	16	17	18	19	20
	21	22	23	24	25
	26	27	28	28	30
	31	32	33	34	35
	36	37	38	39	40
	41	42	43	44	45
	46	47	48	49	50
	51	52	53	54	55
	56	57	58	59	60
	61	62	63	64	65
	66	67	68	69	70
	71	72	73	74	75
	76	77	78	79	80
	81	82	83	84	85
	86	87	88	89	90
B组	3μm-1	3μm-2	3μm-3	3μm-4	3μm-5
	3μm-6	3μm-7	3μm-8	3μm-9	3μm-10
	5μm-1	5μm-2	5μm-3	5μm-4	5μm-5
	5μm-6	5μm-7	5μm-8	5μm-9	5μm-10
	10μm-1	10μm-2	10μm-3	10μm-4	10μm-5
	10μm-6	10μm-7	10μm-8	10μm-9	10μm-10

熔封后的样品在121℃灭菌15分钟。

2.2样品无菌确认

将灭菌的样品倒转，使培养基与容器内表面充分接触，在30~35℃下正置培养14天。

表6 A组无菌确认结果

样品序号	确认结果	样品序号	确认结果	样品序号	确认结果
1	—	31	—	61	—
2	—	32	—	62	—
3	—	33	—	63	—
4	—	34	—	64	—
5	—	35	—	65	—
6	—	36	—	66	—
7	—	37	—	67	—
8	—	38	—	68	—
9	—	39	—	69	—
10	—	40	—	70	—
11	—	41	—	71	—
12	—	42	—	72	—
13	—	43	—	73	—
14	—	44	—	74	—
15	—	45	—	75	—
16	—	46	—	76	—
17	—	47	—	77	—
18	—	48	—	78	—
19	—	49	—	79	—
20	—	50	—	80	—
21	—	51	—	81	—
22	—	52	—	82	—
23	—	53	—	83	—
24	—	54	—	84	—
25	—	55	—	85	—
26	—	56	—	86	—
27	—	57	—	87	—
28	—	58	—	88	—
29	—	59	—	89	—
30	—	60	—	90	—
注：“—”表示澄清，无菌生长“+”表示浑浊，有菌生长

表7 B组无菌确认结果

样品序号	确认结果	样品序号	确认结果	样品序号	确认结果
3μm-1	—	5μm-1	—	10μm-1	—
3μm-2	—	5μm-2	—	10μm-2	—
3μm-3	—	5μm-3	—	10μm-3	—
3μm-4	—	5μm-4	—	10μm-4	—
3μm-5	—	5μm-5	—	10μm-5	—
3μm-6	—	5μm-6	—	10μm-6	—
3μm-7	—	5μm-7	—	10μm-7	—
3μm-8	—	5μm-8	—	10μm-8	—
3μm-9	—	5μm-9	—	10μm-9	—
3μm-10	—	5μm-10	—	10μm-10	—
注：“—”表示澄清，无菌生长“+”表示浑浊，有菌生长

2.3微生物侵入试验

2.3.1铜绿假单胞菌悬液的制备

接种铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释，制成0.lml中含菌数为10～100cfu的菌悬液。

表8促生长实验菌种稀释记录

菌种名称		铜绿假单孢菌
菌悬液稀释过程		1ml菌液+9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液→10^-1→………→10^-8
培养温度（℃）		30-35℃				培养时间			20h
各稀释级菌落数（cfu/0.1ml）
	10^-1		10^-2	10^-3	10^-4		10^-5	10^-6		10^-7	10^-8
平皿1	/		/	/	/		/	42		6	0
平皿2	/		/	/	/		/	48		2	0
平均数	/		/	/	/		/	45		4	0
备注：“/”表示平皿菌数多，难计数。
结论：菌液稀释10^-6，符合规定。

2.3.2培养基促菌生长能力试验——营养性试验

微生物侵入试验所用的正常样品培养14天均不长菌时，取20瓶，每个样品内接种0.1ml的铜绿假单胞菌，菌液浓度：10~100cfu/0.1ml。在30℃~35℃下培养7天，观察是否所有试样都呈阳性结果，并记录。

判断标准：若七天内所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，同时使用革兰氏染色和紫外灯下液体呈蓝绿色荧光的性质，鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。否则试验无效，须弃去全部试样，重新从头开始试样。^（^2）

表9促生长试验培养记录

样品编号	培养天数（培养温度30-35℃）							细菌鉴别试验
样品编号	1	2	3	4	5	6	7	革兰氏染色	荧光
1	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
2	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
3	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
4	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
5	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
6	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
7	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
8	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
9	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
10	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
11	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
12	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
13	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
14	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
15	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
16	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
17	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
18	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
19	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
20	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
注：“—”表示澄清，无菌生长“+”表示浑浊，有菌生长
标准：微生物均应生长良好且生长菌为铜绿假单胞菌。否则试验无效，需重新试验。
结论：微生物生长良好且生长菌为铜绿假单胞菌。

2.3.3挑战菌悬浮液的制备

2.3.3.1从铜绿假单胞菌的新鲜斜面上取一整环培养物，分别接入含10ml无菌胰酪大豆胨液体培养基的试管中，在30～35℃下培养16～18小时。将每管的培养物分别转入含1000ml胰酪大豆胨液体培养基的容器内，在30～35℃下培养18～24小时。在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊。培养结束后的菌悬液即可用来做容器密封系统完整性试验。

2.3.3.2平板计数，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将菌液稀释成1:10、1:10²、1:10³等稀释级，每稀释级制备2个平皿。使用革兰氏染色和紫外灯下液体呈蓝绿色荧光的性质，鉴定并确认接入的菌为铜绿假单胞菌。

2.3.3.3判断标准：每1ml菌悬液所含活菌数必须达1*10⁶cfu/ml。

2.3.3.4计数结果

表10挑战菌悬液稀释记录（使用前）

菌种名称

铜绿假单孢菌

菌悬液稀释过程

1ml菌液+9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液→10^-1→………→10^-6

培养温度（℃）

30-35℃

培养时间

22h

各稀释级菌落数（cfu/ml）

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-6

菌落数

报告数

细菌鉴别试验

革兰氏染色

荧光

平皿1

/

42

4.5*10⁷

G-

蓝绿色

平皿2

/

48

G-

蓝绿色

平均数

/

45

G-

蓝绿色

备注：“/”表示平皿菌数多，难计数。

结论：每1ml菌悬液所含活菌数为4.5*10⁷cfu/ml，符合要求。

2.4微生物侵入挑战试验

2.4.1将新鲜的铜绿假单胞菌的菌悬液倒入不锈钢盆中。

2.4.2将用于微生物侵入挑战试验的阳性样品和正常样品均浸泡在菌悬液中（取出用于微生物侵入挑战试验正常样品20瓶，不经过菌悬液浸泡，用于后续阳性对照试验），阳性样品的打孔位置均在菌悬液液面以下。在菌悬液中持续浸泡4小时，环境温度保持在23℃±2℃。

2.4.3计数结果：浸泡结束时再取一份菌悬液，用平板计数菌悬液的浓度。

表11挑战菌悬液稀释记录（使用后）

菌种名称

铜绿假单胞菌

菌悬液稀释过程

1ml菌液+9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液→10^-1→………→10^-6

培养温度（℃）

30-35℃

培养时间

22h

各稀释级菌落数（cfu/ml）

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-6

菌落数

报告数

细菌鉴别试验

革兰氏染色

荧光

平皿1

/

42

4.4*10⁷

G-

蓝绿色

平皿2

/

46

G-

蓝绿色

平均数

/

44

G-

蓝绿色

备注：“/”表示平皿菌数多，难计数。

结论：每1ml菌悬液所含活菌数为4.4*10⁷cfu/ml,符合要求。

2.4.4从菌悬液中取出样品，擦干样品表面残余的菌悬液，用含70％异丙醇消毒容器外表面。

2.4.5将取出的作为阳性对照的20瓶样品，外表用含70％异丙醇消毒。然后，接种入10~100cfu的铜绿假单胞菌。进行培养基的促生长试验。

表12促生长试验培养记录

样品编号	培养天数（培养温度30-35℃）							细菌鉴别试验
样品编号	1	2	3	4	5	6	7	革兰氏染色	荧光
21	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
22	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
23	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
24	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
25	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
26	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
27	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
28	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
29	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
30	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
31	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
32	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
33	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
34	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
35	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
36	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
37	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
38	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
39	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
40	+	+	+	+	+	+	+	G-	蓝绿色
注：“—”表示澄清，无菌生长“+”表示浑浊，有菌生长
标准：微生物均应生长良好且生长菌为铜绿假单胞菌。否则试验无效，需重新试验。
结论：微生物均生长良好且生长菌为铜绿假单胞菌。

2.4.6微生物浸入试验完成后，取出样品，在30℃~35℃下培养7天，观察样品内微生物生长情况，有生长的样品进行标记“+”，无生长标记“—”。

表13微生物侵入试验培养记录

样品编号	培养天数（培养温度30-35℃）							样品编号	培养天数（培养温度30-35℃）
样品编号	1	2	3	4	5	6	7	样品编号	1	2	3	4	5	6		7
3μm-1	—	—	—	—	—	—	—	3μm-2	+	+	+	+	+		+	+
3μm-3	+	+	+	+	+	+	+	3μm-4	—	—	—	—	—		—	—
3μm-5	+	+	+	+	+	+	+	3μm-6	—	—	—	—	—		—	—
3μm-7	+	+	+	+	+	+	+	3μm-8	—	—	—	—	—		—	—
3μm-9	—	—	—	—	—	—	—	3μm-10	—	—	—	—	—		—	—
5μm-1	+	+	+	+	+	+	+	5μm-2	+	+	+	+	+		+	+
5μm-3	+	+	+	+	+	+	+	5μm-4	+	+	+	+	+		+	+
5μm-5	—	—	—	—	—	—	—	5μm-6	+	+	+	+	+		+	+
5μm-7	+	+	+	+	+	+	+	5μm-8	—	—	—	—	—		—	—
5μm-9	—	—	—	—	—	—	—	5μm-10	+	+	+	+	+		+	+
10μm-1	+	+	+	+	+	+	+	10μm-2	+	+	+	+	+		+	+
10μm-3	+	+	+	+	+	+	+	10μm-4	+	+	+	+	+		+	+
10μm-5	+	+	+	+	+	+	+	10μm-6	+	+	+	+	+		+	+
10μm-7	+	+	+	+	+	+	+	10μm-8	+	+	+	+	+		+	+
10μm-9	+	+	+	+	+	+	+	10μm-10	+	+	+	+	+		+	+
41	—	—	—	—	—	—	—	42	—	—	—	—	—		—	—
43	—	—	—	—	—	—	—	44	—	—	—	—	—		—	—
45	—	—	—	—	—	—	—	46	—	—	—	—	—		—	—
47	—	—	—	—	—	—	—	48	—	—	—	—	—		—	—
49	—	—	—	—	—	—	—	50	—	—	—	—	—		—	—
51	—	—	—	—	—	—	—	52	—	—	—	—	—		—	—
53	—	—	—	—	—	—	—	54	—	—	—	—	—		—	—
55	—	—	—	—	—	—	—	56	—	—	—	—	—		—	—
57	—	—	—	—	—	—	—	58	—	—	—	—	—		—	—
59	—	—	—	—	—	—	—	60	—	—	—	—	—		—	—
61	—	—	—	—	—	—	—	62	—	—	—	—	—		—	—
63	—	—	—	—	—	—	—	64	—	—	—	—	—		—	—
65	—	—	—	—	—	—	—	66	—	—	—	—	—		—	—
67	—	—	—	—	—	—	—	68	—	—	—	—	—		—	—
69	—	—	—	—	—	—	—	70	—	—	—	—	—		—	—
71	—	—	—	—	—	—	—	72	—	—	—	—	—		—	—
73	—	—	—	—	—	—	—	74	—	—	—	—	—		—	—
75	—	—	—	—	—	—	—	76	—	—	—	—	—		—	—
77	—	—	—	—	—	—	—	78	—	—	—	—	—		—	—
79	—	—	—	—	—	—	—	80	—	—	—	—	—		—	—
81	—	—	—	—	—	—	—	82	—	—	—	—	—		—	—
83	—	—	—	—	—	—	—	84	—	—	—	—	—		—	—
85	—	—	—	—	—	—	—	86	—	—	—	—	—		—	—
87	—	—	—	—	—	—	—	88	—	—	—	—	—		—	—
89	—	—	—	—	—	—	—	90	—	—	—	—	—		—	—
备注：“-”表示无菌生长，“+”表示有菌生长
结论：当阳性样品孔径达到3μm时，微生物侵入概率达到了40%，当阳性样品孔径达到5μm时，微生物侵入概率达到了70%，当阳性样品孔径达到10μm时，微生物侵入概率达到了100%。

2.4.7如果试样容器长菌，确认生长菌是挑战微生物---铜绿假单胞菌。

表14阳性样品微生物确认试验

样品编号	细菌鉴别试验		样品编号	细菌鉴别试验
样品编号	荧光	革兰氏染色	样品编号	荧光	革兰氏染色
3μm-2	蓝绿色	G^-	3μm-3	蓝绿色	G^-
3μm-5	蓝绿色	G^-	3μm-7	蓝绿色	G^-
5μm-1	蓝绿色	G^-	5μm-2	蓝绿色	G^-
5μm-3	蓝绿色	G^-	5μm-4	蓝绿色	G^-
5μm-6	蓝绿色	G^-	5μm-7	蓝绿色	G^-
5μm-10	蓝绿色	G^-	10μm-1	蓝绿色	G^-
10μm-2	蓝绿色	G^-	10μm-3	蓝绿色	G^-
10μm-4	蓝绿色	G^-	10μm-5	蓝绿色	G^-
10μm-6	蓝绿色	G^-	10μm-7	蓝绿色	G^-
10μm-8	蓝绿色	G^-	10μm-9	蓝绿色	G^-
10μm-10	蓝绿色	G^-

2.4.8取经过菌悬液浸泡后的未长菌阳性样品及10支未长菌正常样品，外表面用消毒液消毒后，接种10~100cfu铜绿假单胞菌进行促生长试验。

表15微生物侵入试验促生长试验记录

样品编号	培养天数（培养温度30-35℃）							细菌鉴别试验
样品编号	1	2	3	4	5	6	7	荧光	革兰氏染色
3μm-1	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
3μm-4	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
3μm-6	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
3μm-8	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
3μm-9	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
3μm-10	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
5μm-5	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
5μm-8	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
5μm-9	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
70	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
71	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
72	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
73	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
74	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
75	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
76	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
77	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
78	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
79	+	+	+	+	+	+	+	蓝绿色	G^-
备注：“+”表示有菌生长
结论：试样容器长菌，生长菌是挑战微生物---铜绿假单胞菌。

2.5微生物侵入挑战试验有效的判断标准

在挑战试验开始时，挑战用菌悬液浓度（活菌数）达到1*10⁶cfu/ml以上，促生长试验都合格，微生物挑战试验有效。^（^3）

三、研究结论

3.1微生物侵入统计分析

表29微生物侵入统计结果

样品类别	微生物侵入数/测试总数	微生物侵入百分比
正常样品	0/50	0
3μm阳性样品	4/10	40%
5μm阳性样品	7/10	70%
10μm阳性样品	10/10	100%

从以上数据可知，采用铜绿假单胞菌进行微生物挑战试验，微生物侵入与阳性对照孔径直接相关，孔径越大，微生物侵入概率越高，当阳性样品孔径达到10μm时，微生物侵入概率达到了100%。

3.2结论：通过本试验的研究结果，说明微生物侵入法是评估容器密封性一个较好的选择，作为生产中的日常监控，可以有效控制微生物侵入的风险。

参考文献：

（1）国家药品监督管理局药品审评中心，《化学药品注射剂包装

系统密封性研究技术指南（试行）》

（2）张中社，药品微生物检测技术，中国人民解放军第四军医大学出版社

（3）刘志恒，现代微生物学（第二版），科学出版社

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安瓿包装注射液容器密封性检验方法研究