新型冠状病毒实验室检测方法的应用现状及结果解读

新型冠状病毒实验室检测方法的应用现状及结果解读

崔紫云 孟营 刘淑妍

内蒙古呼伦贝尔市第四人民医院 检验科

摘要：本文首先对新型冠状病毒肺炎作出概述，介绍了实时荧光RT-PCR核酸检测方法，并对核酸和抗体联合检验结果进行解读，以供参考。

关键词：新型冠状病毒；实验室检测方法；应用

引言：针对新型冠状病毒肺炎，临床中需要有效且快速地对疑似患者和不同病程的患者加以确切诊断。关于病原学的检查，核酸检测是首选方法，通过特异性IgG与IgM的检验，不但可以为疾病的诊断提供帮助，同时可以评定患者所处的感染阶段。但在临床实践应用过程中，核酸检测也具有“假阴性”方面的问题，这是值得思考的问题。

一、新型冠状病毒肺炎概述

关于新型冠状病毒肺炎，其是一种急性病毒性疾病，因新型冠状病毒所引发的经人体呼吸道传播的疾病。当前，对于新型冠状病毒的检验，临床中首要的选择方法是2019-nCoV核酸检测。这一检测方法应用实时荧光定量RT-PCR技术，利用对荧光信号所产生变化的监测针对新冠病毒核酸加以检验。2019-nCoV核酸检测技术存在较高的特异性和灵敏性，可以在早期进行快速地诊断，能够及早发现传染源，且由根源上对疫情加以控制，避免了由于不能及时诊断和隔离导致疫情的控制受到相应影响。

二、实时荧光RT-PCR核酸检测

研究方法和技术路线：通过荧光定量PCR技术对新冠病毒进行核酸检测，借助对荧光信号实际变化情况的监测检验病毒核酸，同时利用相关检测内标对待测标本中可否存在PCR抑制物加以检验。

研究用到的相关仪器：提取仪：杭州奥盛auto-pure96；扩增仪：杭州博日FQD-96A；提取试剂：重庆中元；扩增试剂：四川迈克。

实施方案：完成鼻咽拭子样本采集工作以后，高盐环境状况下，令病毒或是细胞快速完成裂解，并将核酸释放出来，通过重复的吸磁脱磁与充分地洗涤，获取相应的纯化核酸物质，然后对实时营养定量PCR技术加以应用，实现对纯化核酸的模拟体外扩增，对目的基因进行获取，使基因靶标检测得以完成。

新型冠状病毒属于RNA病毒，首先对RNA进行逆转录，使其变为DNA，如果样本具有相应的靶序列，模板和TaqMan探针相互结合，DNA链扩增产生荧光，对荧光达到阈值时对应的Ct值加以检验，病毒核酸浓度越高，对应的Ct值便越小。试剂盒检测的原理大体相同，然而官方并没有对检测引物与探针的序列加以规定，部分试剂盒对三个靶基因区域进行检测，部分试剂盒对两个靶基因区域进行检测，也有部分只是针对单基因区域进行检测。例如，华达生物科技研制的试剂盒仅仅对ROF lab基因进行靶向检测。亦有相关学者提出建议，把ROF lab基因当作诊断序列，把N基因当作筛检序列。

除却需要研制相应的试剂盒以外，针对弱阳性标本应开发具有更高敏感度的检验方法。相关团队研发了一种以CRISPR为基础的SHERLOCK技术，该项技术可以实现新型冠状病毒特异性RNA的快速检验。经过测试，该项技术可以在较低的RNA溶度下，对新型冠状病毒RNA序列进行精准检验。也有团队研制出多重探针扩增技术，利用溶解曲线与TaqMan技术的有效融合，针对多个靶标进行多次检验，覆盖包含新型冠状病毒在内的18种呼吸系统病毒。

尽管实时荧光RT-PCR核酸检测方法被当作新型冠状病毒肺炎诊断的“金标准”，存在比较高的特异性和灵敏度，且相应的检测周期较短，然而其也存在一些因素会对检测结果造成一定影响。第一，检测试剂的有效性。基于疫情紧迫性与严重性的考虑，当前的核酸检测试剂盒大部分都是经国家药监局应急审批程序获批紧急上市，这样的措施尽管使疫情防控工作得到了一定缓解，但由于检测试剂的不足促使部分疑似病例不能及早进行诊断问题的产生，亦由于缺少充足的时间针对检测试剂实施先期临床试验，无可规避地存在一些产品的有效性很难获取有效的保障。第二，各种不同产品选取扩增的序列有所不同，在试剂特异性和敏感度方面存在一定差异。第三，标本采集的种类。肺中表达ACEⅡ细胞存在超过80%都是Ⅱ型肺泡上的皮细胞，也就是人体下呼吸道中的痰和肺泡灌洗液等分泌物相应的检测结果可能比上呼吸道更优。第四，标本采集阶段。针对一般的快速抗原，其检验在大约一周的时间中通常显示为阴性的结果。有关团队研究证实患者暴露的第二周，对应的咽拭子标本核酸检验的阳性率才能达到100%，而且伴随时间的推移，阳性率会呈现出渐渐下降的发展趋势，也就是说，样本收集过早或是过往都会各核酸检验的结果造成一定影响。第五，样本的运输和保存。样本需要放置在病毒保存液中进行保存，常温下需要在四小时内进行检验，针对24小时内检验的样本，可以放置在4度的环境下进行保存。针对24小时内不能检验的样本，需要放置在-70度或是更低的温度环境下进行保存。由此可见，依然需要探寻相应的检验方法对核酸检验“假阴性”的不足加以弥补。

三、核酸和抗体联合检验结果的相应解读

因为联合运用核酸检验和特异性抗体检验，能够明显提升新型冠状病毒感染相应的检测效率，则针对以上两种方法的联合检验结果或许可以得到正确的解读。通常状况下，病毒感染大约一周的时间，会产生IgM，这是病毒急性期感染的相关诊断指标。然而浓度比较小，相应维持的时间也相对偏短。病毒感染以后大约三周的时间，IgG产生，同时会长时间存在于患者的机体中，对应的抗体滴度会存在一个连续性升高的过程。根据以上规律，我们便能够借助核酸检验和特异性抗体相应的检验结果，针对是否感染的新型冠状病毒作出相应的判断。

在核酸检验结果显示为阳性时，可以利用对IgG与IgM相应检验结果多次动态性变化的观察，给出比较明确的诊断意见。不管后续核酸检验可否呈现阳性，如果患者大约一周时间机体中再一次检验出相应抗体，IgG从原本的阴性转变为阳性，或是连续性升高四倍之上，那么便可以判定是急性或是近期感染。诚然，基于免疫方法学相应检测所具有的特性，应重复对IgG与IgM动态性检验的重要性加以强调，以尽量减少“假阳性”结果给临床诊断和治疗工作开展造成的误导。

结束语：总而言之，对于新型冠状病毒肺炎，实验室检测是非常主要的检测方法，临床实验室应对核酸检验加以重视，与特异性IgG、IgM检测联合应用，这样可以显著提升病毒的检测效率。然而依然需要更为深入地根据临床表征与流行病学史加以全面分析。伴随新型冠状病毒肺炎检测试剂及方法的不断增多，确保信息资源的共享十分关键，实施多中心大规模的临床试验和方法学性能评估，确保当前检测方法更加有效与精准。

参考文献：

[1] 李红鹏, 闫雅茹, 张柳,等. 新型冠状病毒肺炎实验室诊断方法及意义[J]. 国际呼吸杂志, 2021, 41(02):81-85.

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