高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用研究

高效液相色谱法简介及其在药品检验中的应用研究

陆建轶

绍兴市柯桥区食品药品检验检测中心 312065

摘要：随着固体制剂的一致性评价的推进，以及注射剂安全性评价即将来临，药用辅料的质量研究越来越受到重视。高效液相色谱法作为现代药品检验重要的检测手段在药用辅料检验中也发挥着重大作用。本文简介高效液相色谱法在药用辅料检测中应用。

关键词:高效液相色谱法;药品检验;应用

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ 高效液相色谱法）是色谱法的一个重要分支，应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20% ，而80%则需用高效液相色谱来分析。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点，已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

一、检测条件

目标优化梯度条件，确定分析波长。

1、 样品溶剂选择；

2、 滤膜吸附试验；

3、 DAD检测器下，波长选择主成分最大吸收或平台处。

4、 分离条件选择；

5、 色谱柱对比；（根据情况酌定）

6、DAD检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料（制剂研究时需同时进行空白辅料破坏）等成分分离。

二、一般技术要点说明

1、 一般在无参考标准或标准的方法无法直接套用时,需进行此项研究内容，如3类药。

2、样品溶剂：对样品有很好的溶解能力，实验室自然放置稳定存放12小时以上，与流动相有良好的互溶效果。

3、续滤液峰面积达稳定最大值，续滤液体积在5ml以下时较为适宜，否则需要重新筛选溶剂。

4、破坏程度10%左右（5%—15%）为宜，2mol/l酸或碱90℃水浴12小时无破坏即视为样品稳定，不必再追求降解度。4500lx光照48小时，样品粉末及溶液需要同时做。破坏后的样品溶液及空白溶剂均需调整至流动相pH方可进样，可避免对色谱柱产生不良影响。如果破坏超过20%，需要降低破坏条件。

5、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

6、梯度变化要有最高洗脱能力过程，目的证明所有的杂质成分均能够被洗脱检测。

7、方法摸索优化实验一般是不上资料的，只是体现在实验记录本中，除非是没有方法依据时，如3类药申报时，梯度选择及波长选择等均需要在资料中体现。

8、方法优化完成后，最后在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

9、方法摸索优化实验采用工艺已经确定的实验室小试、实验室放大样品进行，前期用于原料合成样品配合检测时，可以采用大范围的梯度洗脱进行模糊检测分析。

三、检测目的

目的为了验证方法对目标成分检测的区分能力及全面的杂质分析评价。

DAD检测器或适宜的通用型检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料，各杂质对照品等在同一天进行分析，可以作为申报资料中杂质谱的论述内容。

1、参照上述过程进行破坏样品制备，空白及阴性样品都要做。

2、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

3、梯度要有最高洗脱能力过程。

4、以前期确定的分析条件及方法，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

5、本部分数据进资料，最佳采用生产线验证的第1批样品进行。

当色谱条件与有关物质检查方法相同时，专属性实验数据可以共用。

出图时主成分峰的紫外光谱图及峰纯度图均要出图。

四、检测过程

1.采用对照品进行。

线性范围一定要将回收率试验的最高浓度包含进去，否则回收率浓度超过线性范围，缺乏定量依据，这个错误非常常见。

2.精密度

同一份供试品（样品）溶液，连续进6次。计算峰面积RSD<2%，资料中体现7张图（1张空白，6张样品液）。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

3.溶液稳定性

与精密度在同一天穿插进行，实验前进行良好的排序设置，能共用的图尽量共用减少工作量。以下时间点必做（除非已知稳定性情况可减少时间点）。0、4、6、8、10、12、18、24。实验过程中可取精密度中的图作为2h或4h，甚至6h。做7至8个时间点，在撰写申报资料时最后以6个数据填报。

溶液稳定性数据至少做到16h稳定（尽量做得更长时间，都是自动进样，一个过夜就至少在12小时以上，时间太短无法证明溶液稳定性），极特殊情况下可以采用低温进样器或特殊的保存方法或现配现分析等操作，但要求有数据作为支持依据，方可将特殊处理方法定入标准。6个数据计算峰面积RSD<2%。

4.重复性

同一批号样品，同一人员同法操作分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。计算含量RSD<2%，资料中体现9张图（1张空白，2张对照，6张样品）。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

中间精密度同一批号样品，不同人员，不同设备，同法操作，分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。推荐次日操作，避免产生压针的疑问（万一审评老师没有注意到设备编号，所以别自找麻烦，推荐次日操作）。对照品也要重新称取。与重复性的6个数据，共同参与统计，计算12个含量数据结果，RSD<2%，资料中体现18张图，其中重复性9张，次日数据9张（1张空白，2张对照，6张样品）。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

准确度采用回收率试验方式进行，通常采用直接回收率实验法，按照80%、100%、120%比例分别称取样品，同法操作，每个比例各3份样品，各进1次。以中间精密度的含量均值作为理论含量，计算回收率，回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

制剂采用加样回收率测定：采用20片或粒制剂单位终产品混合研碎后，按比例称取进行加样回收，加样回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加样回收率不能达标时（辅料有吸附或干扰较大时），方可采用直接回收率。回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。

5.耐用性实验

改变色谱柱不同品牌的色谱柱，共3个品牌。比较分离度，保留时间，含量测定结果。如果品牌不足3个可采用多个批号或不同品牌多个批号的方式，不能采用废柱子进行实验。最好在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。3个品牌的色谱柱共15张图（每个色谱柱1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。流动相比例流动相的低组分比例变化约±5%。最好在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。

3个不同比例的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。最优标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。

参考文献

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