浅谈Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响

浅谈 Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响

陈亚海 1

1吴川市吴阳农业农村服务中心；广东湛江；524000

2吴川市塘缀农业农村服务中心；广东湛江；524000

摘要：本研究检测了Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞中相关基因表达的影响作用，结果发现Wnt4重组蛋白能够显著上调FSHR和CTNNB1的表达，并对StAR和CYP11A1的表达有一定的促进作用。本研究的结果可为深入研究Wnt4的具体功能提供一定的研究基础，也可为进一步阐明鸡卵泡选择的分子机制提供参考。

关键词：鸡；卵泡选择；Wnt4；qRT-PCR

1.引言

鸡的卵泡选择与产蛋量高度相关，研究卵泡选择的分子机制可为提高其产蛋性能提供一定的理论依据。Wnt信号通路能够调控很多卵巢生长发育过程中的生理过程，如卵泡发育、排卵和黄体化。Wnt4是Wnt家族的成员，对雌性动物的生殖系统起到一定的调控作用。为了研究Wnt4对鸡卵泡选择的调控作用。本研究主要检测了Wnt4重组蛋白对鸡等级卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响，可为阐明Wnt4的功能提供一定的研究基础，也可为提高鸡的产蛋性能和繁殖力提供一定的理论参考。

2.材料和方法

2.1实验材料

（1）实验动物。随机选取三只200日龄处于产蛋高峰期的母鸡（海兰褐壳蛋鸡）及时处死，取其所有卵泡按标准分好等级，用于培养卵泡颗粒细胞。

（2）实验器材。超低温冰箱、低温高速离心机、荧光定量PCR仪、PCR仪、稳压电泳仪、凝胶成像系统、超净工作台、电子天平、制冰机、高压蒸汽灭菌器、二氧化碳培养箱、微量高速离心机、移液器、电热恒温鼓风干燥箱、正置照相显微镜、细胞低速离心机、超纯水机、细胞培养板等实验耗材。

（3）实验试剂。Wnt4重组蛋白，M199培养基，胰酶，胎牛血清，青链霉素，Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇， RNaseFreeH₂O，DNA markers，SYBR Premix ExTaqII 定量试剂盒，反转录试剂盒，II型胶原酶，胎牛血清，青链霉素，PBS等。

2.2实验方法

2.2.1鸡卵泡颗粒细胞的培养

（1）产蛋高峰期母鸡，使用颈静脉放血的方式杀死，用消毒的小剪刀完整取下卵巢，用消毒的大剪刀剖开腹部，投入盛有3%青链霉素PBS（实验前注意进行灭菌）的无菌大烧杯中，进入无菌间完成分离。注取卵巢时应注意保持卵泡的完整。

（2）选择直径12mm以上的各级卵泡，逐个取下放于盛有3%青链霉素PBS的灭菌平皿中，在超净工作台中，用左手拿尖头镊子，右手用尖头镊子将卵泡的外层膜挑开进行剥离，剥离后暴露基膜层，用尖头镊子剪破基膜层放出卵黄，为了免损伤颗粒层，在释放卵黄时动作的一定要轻柔，颗粒层中可能带有卵黄，为减少卵黄的含量可以洗涤几次，释放出卵黄后，将基膜层和颗粒层进行分离，分离后颗粒层放入盛有3%青链霉素PBS的烧杯或培养皿中。

（3）向颗粒细胞层中加入适量胰酶（实验前检测要确定其无污染），放入恒温37℃的CO₂培养箱中进行培养，处理15min。

（4）颗粒层处理好后加入PBS终止消化，1800rpm离心5min，弃去上清，加PBS吹洗，1800rpm离心5min，弃去上清。

（6）根据沉淀多少用适量新的培养液把离心管底部的细胞沉淀进行重悬，在24孔板中先加入少量培养液（200ul，第一列四个孔即可），然后每孔加入100uL，150uL，200uL，250uL重悬的细胞于24孔板第一列的四个孔中，用显微镜进行观察，选择适宜的细胞密度进行后续的布板。

（7）每孔中加入适量的细胞悬液，用新的培养液补足充至1000uL，将接种好的板轻轻放入恒温37℃的CO₂培养箱进行培养，CO₂浓度为5%。

（8） 接种后12h进行换掉部分培养液液，培养24h左右换掉全部培养液，注意换液时用PBS进行清洗，清洗动作轻柔，防止细胞贴壁不紧而导致细胞大量流失。

（9）培养到细胞贴壁85%左右用于后续实验。

2.2.2 Wnt4重组蛋白处理鸡卵泡颗粒细胞

向不同孔的颗粒细胞中分别添加不同剂量的Wnt4重组蛋白（0,5,100,500ng/mL），每个浓度组重复三孔，处理48h后收集细胞。

2.2.3鸡卵泡颗粒细胞的RNA提取

本实验使用Trizol法提取总RNA，详细操作步骤如下：（1）用PBS清洗两次准备提取RNA的细胞，将1mL Trizol加入培养板的孔中，用移液器吹打，将细胞裂解下来，转移到新的1.5mL的离心管中，置于冰上充分裂解12min左右。4℃，12000rpm，离心90s左右。将适量上清液转移至新的离心管中（避免吸取沉淀）；（2）向离心管中加入200μL氯仿，用力摇匀，置于室温（15-30℃）静止5min；（3）4℃ 12000rpm离心15min，管中的液体将分为三层：上层清澈，中间为白色沉淀，下层红色，将上清转移至一个新的离心管中。吸取上清大约为450µL，注意吸上清尽量不要太多，以免吸到蛋白质，污染RNA；（4）向取得的上清液中加入500µL冰异丙醇，缓慢上下颠倒离心管直至充分混匀，置于冰上10min，沉淀RNA；4℃12000rpm离心10min，弃上清；（5）向沉淀中加入600µL 70%乙醇，轻微振荡，4℃ 12000rpm离心10min，洗涤RNA，吸出上清；（6）打开离心管盖，晾干残存的乙醇，约3-5min后加入50μL RNase Free H

₂O溶解，于-80℃冰箱内分装保存，备用；（7）RNA质量及浓度检测：电泳检测RNA的质量和浓度，并用紫外分光光度计检测A260/A280、A260/A230的值。

2.2.4RNA反转录后进行qRT-PCR检测

（1）反转录合成cDNA：cDNA的合成按照TakaRa公司反转录试剂盒的操作步骤进行详细步骤如下：

第一，基因组DNA的去除反应。按2-1配成反应体系，置于金属浴中，程序为：42℃ 2min，4℃保存。

表1 DNA 去除反应体系组分

表2反转录反应体系组分

2. 运用Primer Premier 5软件，按照qRT-PCR引物设计原则，设计荧光定量PCR引物，引物由上海生工生物有限公司合成。

3. 在荧光定量PCR仪上进行基因mRNA表达水平检测。各cDNA以β-actin为持家基因进行相对定量PCR反应。反应体系见表3。荧光定量引物见表4。每个样品重复三次。PCR采用两步法，反应条件为：95℃预变性30s；95℃ 5s，60℃ 20s，循环数为 40；熔解曲线：95℃ 1s，65℃ 15s，95℃ 1s。同时将各个样品的cDNA取出等量混池，并以此为模板进行2倍梯度稀释，以持家基因和目的基因特异性引物来进行扩增，建立标准曲线。最后用2^-△△Ct的方法算出基因的表达水平，确定基因的相对表达量。

表3 qRT-PCR反应体系组分

表4 荧光定量PCR引物

2.3 数据统计分析

所有数据均用IBS SPSS Statistics 21分析，结果用平均数±标准误表示，不同组之间利用单因素方差ANOVA和邓肯式检验进行，结果均以P<0.05为差异显著。

3.结果

结果如图1所示，Wnt4重组蛋白对于StAR和CYP11A1的表达没有显著的影响，但随着Wnt4重组蛋白浓度的增大，StAR和CYP11A1的表达有一定上升的趋势。由此可见，高浓度的Wnt4重组蛋白能够上调StAR和CYP11A1的表达。

图1重组蛋白Wnt4对等级卵细胞颗粒中STAR、CYP11A表达的影响

当Wnt4重组蛋白浓度为5ng/mL时，FSHR的表达量出现了显著的上调，说明Wnt4重组蛋白对于FSHR的表达具有一定的调控作用。FSHR作为FSH的受体，在卵泡选择的过程中发挥了重要的调控作用。

图2重组蛋白Wnt4对等级卵细胞颗粒中FSHR表达的影响

当Wnt4重组蛋白浓度为5ng/mL和500ng/mL时，CTNNB1的表达量出现了显著的上调，说明Wnt4重组蛋白对于CTNNB1的表达具有一定的调控作用。CTNNB1作为Wnt信号通路的关键成员，对于Wnt信号通路的作用发挥起到了至关重要的作用，也能够在卵泡选择的过程中发挥一定的调控作用。

图3重组蛋白Wnt4对等级卵细胞颗粒中CTNNB1表达的影响

这些结果说明，Wnt4重组蛋白能够促进相关基因的表达，从而对于等级颗粒细胞的分化和卵泡发育有一定的促进作用，具体的作用机制还需要进一步的研究。

参考文献

[1].王玉玲,胡金朝.我国家禽品种多样性及保护[J].中国动物学会成立65周年年会,1994.

[2].张金壁.类固醇激素合成酶及相关受体表达与猪卵泡闭锁过程的关系研究[J].南京农业大学学位论文,2010.