手性高效液相色谱法测定伊德利塞中对映异构体

刘肖肖 1，李扬眉 2，李靓 1，骆婷婷 1，孙井龙 1

1.南京华威医药科技集团有限公司，南京 210046； 2.南京格亚医药科技有限公司，南京 210046

摘要：采用手性高效液相色谱法建立了一种测定伊德利塞对映异构体的方法，用于S-构型伊德利塞光学纯度的分析研究。检测方法采用硅胶表面共价键合直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）填料（CHIRALPAK IA）为固定相，以正己烷-甲醇-乙醇（80：10：10）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，柱温25℃。该方法下S-伊德利塞与R-伊德利塞之间的分离度为6.15；R-伊德利塞质量浓度在0.50~9.96 μg·mL^-1范围内线性关系良好，线性方程为y=38.122 x-6.397，r=0.999；R-伊德利塞的定量限和检测限浓度分别为0.25 μg/mL和0.09 μg/mL；低、中、高3个浓度的R-伊德利塞回收率（n=3）分别为100.3%、104.7%、103.2%，RSD（n=9）为2.7%；供试溶液在室温放置8小时内稳定性良好。经检测，多批次S-伊德利塞中R-伊德利塞的含量为0.15%~0.20%。结果表明，所建立的方法经方法验证可准确可靠的测定伊德利塞中的对映异构体。

关键词：伊德利塞；喹唑啉类化合物；恶性血液病；对映异构体；手性高效液相色谱法

中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：

The determination of Idelalisib enantiomer by Chiral HPLC

LIU Xiao-xiao^1*，LI Yang-mei²，LI Liang¹，LUO Ting-ting¹，SUN Jing-long¹

(1.Nanjing Huawe Medicine Technology Group Co. Ltd., Nanjing 21046,China；2.Nanjing Gear pharmaceutical Technology Co. Ltd., Nanjing 21046)

ABSTRACT： To establish a Chiral HPLC method to determination Idelalisib enantiomers for optical purity analysis research of R-Idelalisib. The method was performed on a Chiralcel IA column[The silicone surface covalent bond amylose tri(3,5-dimethyl phenyl carbamate(chiral stationary phase].The mobile phase was n-hexane-methanol –ethanol(80:10:10)at a flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was 25℃ and the detection wavelength was 270 nm. The resolution between the peaks of S-Idelalisib and R-Idelalisib was 6.07. The method was found to show good linearity over the concentration range of 0.50~9.96 μg/mL. The linear equation was y=38.122 x-6.397, and the regression coefficient was 0.999. The limit content of quantification and limit content of detection of R-Idelalisib were 0.25 μg/mL and 0.09 μg/mL, respectively. The recoveries of R-Idelalisib(n=3)were 100.3%, 104.7% and 103.2% respectively at the concentration level of low, medium and high, with the RSD(n=9)of 2.7%.The test solution was stable for at least 8h at 25℃.The R-Idelalisib content in batches S-Idelalisib sample was 0.15%~0.20%. Results show that the method by the methods validation, the method can be accurately and reliably used for determination Idelalisib enantiomers.

KEY WORDS： idelalisib; quinazoline; malignant hematological disease; enantiomer; chiral HPLC

伊德利塞（Idelalisib）为喹唑啉类化合物，化学名为5-氟-3-苯基-2-((1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)丙基)-3H-喹唑啉-4-酮。是一种选择性磷脂酰肌醇3激酶δ(PI3Kδ)抑制剂。伊德利塞通过抑制PI3Kδ可以阻断若干驱动B细胞繁殖和存活的信号通路，从而诱导B细胞凋亡，抑制B细胞增殖^[1-3]。伊德利塞主要适应症是用于治疗复发慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、复发滤泡B-细胞非霍奇金淋巴瘤（FL）及复发性小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）的血癌患者^[4-5]。

伊德利塞存在有1个不对称碳原子，存在S-型、R-型2个异构体。研究显示二氢吡啶类化合物对映体的体内活性差异较大，S-型表现出抑制PI3Kδ激酶活性的极佳能力。临床试验研究中主要采用的为至少含有95% S-型的伊德利塞^[6]。2014年7月和9月被FDA和EMA批准的Zydelig^®就为S-型伊德利塞^[7]。因此建立一种R，S-构型伊德利塞的分离及检测方法显得尤为重要。目前，国内外尚未有关于伊德利塞或其他喹唑啉类对映异构体的检测方法的相关文献报道。本文采用高效液相色谱法在正相条件下采用手型固定相直接分离检测伊德利塞对映异构体，所建立方法具有操作简便，灵敏度高，精密度好的特点^[8-9]。

S构型伊德利塞（S-Idelalisib） R构型伊德利塞（R-Idelalisib）

图1 S构型和R构型伊德利塞结构式

Fig. 1 S-Idelalisib and R-Idelalisib structure of aranidipine

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱系统（包括自动进样器、柱温箱、VWD检测器、Agilent Chemstation色谱数据工作站；Agilent公司）；CHIRALPAK IA（250×4.6 mm，5 μm）色谱柱（填料：硅胶表面共价键合直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）；Daicel公司）；XS105 电子天平（Mettler Toledo公司）。

正己烷、乙醇、甲醇为色谱纯。S-伊德利塞样品（批号：YD0621）及伊德利塞对映异构体（批号：YD01DYT）由南京华威医药科技集团有限公司提供。S-伊德利塞及R-伊德利塞对照品（化学纯度分别为99.91％和99.01％；光学纯度≥99.80%）由南京华威医药科技集团有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

溶剂：正己烷-甲醇-乙醇（6：2：2）。样品溶液：取S-伊德利塞适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1 mL中约含1.0 mg的溶液，即得。S-伊德利塞对照品溶液：精密量取供试品溶液适量，加溶剂定量稀释成每1 mL中约含10 μg的溶液，即得。R-伊德利塞对照品溶液：精密称取R-伊德利塞适量，加溶剂定量稀释成每1 mL中约含10 μg的溶液，即得。系统适用性溶液：精密称取S-伊德利塞及R-伊德利塞各适量，分别加溶剂溶解制成每1 mL中约含1.0 mg的溶液，作为储备液；精密量取上述储备液适量于同一容量瓶，定量稀释成每1 mL中约含10 μg的溶液，摇匀，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：CHIRALPAK IA柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：正己烷-甲醇-乙醇（80：10：10）；流速：每分钟1.0 mL；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.3 分离度试验

精密量取溶剂、系统适用性溶液和S-伊德利塞样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，典型色谱图见图2和图3。结果表明，在选定的色谱条件下，S-伊德利塞峰与R-伊德利塞峰能够完全达到分离，出峰时间适宜，两个色谱峰之间的分离度为6.15；理论塔板数分别为6269和4291，表明本方法的专属性良好。

2

1

1. S-伊德利塞（S-Idelalisib, t_R=7.367 min）2. S-伊德利塞（S-Idelalisib, t_R=10.483 min）

图2 系统适用性溶液HPLC图谱

Fig.2 HPLC chromatography of system solution

2

1

1. S-伊德利塞（S-Idelalisib, t_R=7.307 min）2. S-伊德利塞（S-Idelalisib, t_R=10.497 min）

图3 S-伊德利塞样品溶液HPLC图谱

Fig.3 HPLC chromatography of system S-Idelalisib solution

2.4 检测限与定量限

取S-伊德利塞对照品及R-伊德利塞对照品溶液用溶剂进行逐级稀释，分别以基线噪声的10倍信噪比和基线噪声的3倍信噪比作为定量限和检测限浓度。在选定的色谱条件下，S-伊德利塞和R-伊德利塞的定量限浓度均为0.25 μg/mL，检测限浓度均为0.09 μg/mL。

2.5 线性与范围

分别精密称取S-伊德利塞和R-伊德利塞各约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至每1 mL约含0.10 mg的溶液，作为线性储备液；精密量取储备液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、3 mL、5 mL、8 mL、10 mL分别置100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，作为各梯度浓度溶液。精密量取各梯度浓度溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以质量浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得S-伊德利塞和R-伊德利塞的回归方程分别为：y=36.761 x-5.599，r=0.999；y=38.122 x-6.397，r=0.999。结果表明，R-伊德利塞及S-伊德利塞质量浓度均在0.50~9.96 μg/mL范围内，均呈良好的线性关系。R-伊德利塞相对于S-伊德利塞的校正因子为1.0。

2.6 回收率试验

精密称取R-伊德利塞适量，加溶剂溶解制成每1 mL中约含1.0 mg的溶液，作为S-伊德利塞储备液；精密量取上述储备液适量，用溶剂溶解并制成5 μg/mL的溶液，作为对照品溶液；取S-伊德利塞适量，精密称定，分别按0.25％、0.50％、0.75％的量加入R-伊德利塞储备液，用溶剂配制成每1 mL含S-伊德利塞1.0 mg的供试品溶液，平行配置3份。分别精密量取上述各溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。按“2.2”项下色谱条件分析，按外标法以峰面积计算，R-伊德利塞低、中、高3个浓度的回收率（n=3）分别为100.3%、104.7%、103.2%，RSD（n=9）为2.7%。

2.7 进样精密度试验

精密称取S-伊德利塞与R-伊德利塞各约10 mg，置同一10 mL容量瓶中，用溶剂溶解成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为储备液；精密量取0.5 mL至100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液10 μL，连续进样6针，以峰面积计算S-伊德利塞与R-伊德利塞的RSD（n=6）分别为1.8%和1.4%。试验结果见下表1。

表1 进样精密度试验结果（n=6）

Tab.1 Results of sampling precision tests（n=6）

2.8 重复性试验

精密称取S-伊德利塞适量，用溶剂溶解并稀释成约1.0 mg/mL的溶液，作为供试品溶液，平行配制6份样品；分别精密量取1.0 mL置至100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，作为自身对照溶液；精密称取R-伊德利塞适量，加溶剂溶解制成5 μg/mL的溶液，作为对照品溶液；精密量取上述各溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按“2.2”项下色谱条件分析，按照外标法和自身对照法分别计算S-伊德利塞中R-伊德利塞浓度的含量。结果表明，两种算法下检出的S-伊德利塞中R-伊德利塞的含量结果一致，均为0.20%，故可采用更为简便的自身对照法代替外标法检测S-伊德利塞中的R-伊德利塞含量。试验结果见下表2。

表2 重复性试验结果（n=6）

Tab.2 Results of repeatability tests（n=6）

2.9 溶液稳定性试验

精密称取S-伊德利塞与R-伊德利塞各适量，加溶剂使溶解并稀释成各约10 μg/mL的溶液，作为系统适用性溶液。精密量取10 μL，分别于0、2、4、6、8小时注入液相色谱仪；记录色谱图，考察溶液稳定性，结果表明，在8小时内S-伊德利塞和R-伊德利塞的峰面积的RSD分别为0.61%和0.87%，表明供试溶液在8小时稳定性良好。

2.10 R-伊德利塞的含量测定

取多个批次的S-伊德利塞，按照“2.1”“项下的溶液配置方法和2.2”项下的色谱条件分析，以自身对照法计算S-伊德利塞样品中R-伊德利塞的含量，经检测，多批次S-伊德利塞中R-伊德利塞的含量为0.15%~0.20%。各批次检测结果见下表3。

表3 多批次S-伊德利塞中的R-伊德利塞的含量结果

Tab.3 The R-Idelalisib content of S-Idelalisib with various batches

3 讨论及结论

色谱柱的选择 通过对比CHIRALPAK的OD-H，AD-H和IA手性色谱柱，采用OD-H柱时S-伊德利塞与R-伊德利塞达不到基线分离，采用AD-H柱时S-伊德利塞与R-伊德利塞仅略有分离，采用IA柱时S-伊德利塞与R-伊德利塞可以较好分离，分离度可达6.15。

流动相比例对分离的影响 将流动相中正己烷的比例分别调整为78%、80%以及82%。结果显示，随着流动相中正己烷比例的增加，S-伊德利塞与R-伊德利塞的保留时间明显延长，但两者的分离度由5.70增加至6.27。为确保方法的耐用性，选择适宜的保留时间，最终选择的流动相比例为正己烷-甲醇-乙醇（80：10：10）。

流速对分离的影响 以正己烷-甲醇-乙醇（80：10：10）为流动相，柱温25℃，调节流速为0.9 mL/min、1.0 mL/min和1.1 mL/min，考察不同流速对伊德利塞对映异构体分离的影响，结果表明，随着流速降低，S-伊德利塞与R-伊德利塞的保留时间略有延长，两者之间的分离度略有增加（由5.83增加至6.17）；综合考虑保留时间和分离度的影响，最终选择较为常用的1.0 mL/min流速作为试验色谱条件。

柱温对分离的影响 以正己烷-甲醇-乙醇（80：10：10）为流动相，流速1.0 mL/min，调节柱温为23℃、25℃和27℃，结果发现温度的升高或降低对S-伊德利塞和R-伊德利塞之间的分离度和理论板数没有明显影响，故从色谱柱使用寿命角度考虑，选择更接近室温的25℃柱温作为试验色谱条件。

小结 本文建立的手性固定相高效液相色谱法测定伊德利塞对映异构体方法的灵敏度高、分离效果好、操作过程简便，可有效的分离检测R构型和S构型的伊德利塞，为进一步准确评估伊德利塞对映异构体的含量提供了较为可靠的检测方法。

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1*通讯作者：刘肖肖，男(1988-)，硕士，中级工程师。研究方向：药物分析与质量研究。E-mail：liuxiaoxiao01@163.com

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