实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用

实时荧光定量 PCR在流感病毒核酸检测中的应用

陈玉梅 伊春市疾病预防控制中心 黑龙江 伊春市 153000

【摘要】目的：探讨在实施流感病毒核酸检测中实时荧光定量PCR检验方式运用可行性。方法：选取2018年1月1日～2020年12月31日，我中心收到的300件流感样病例咽拭子作为研究对象；针对流感病毒核酸利用实时荧光定量PCR完成检测，就获得结果进行分析。结果：对于300件流感样病例咽拭子完成检测后，80件获得流感病毒核酸阳性结果；其中56例属于甲型H1N1病毒，15件属于季节性甲3亚型病毒，6件属于季节性甲1型病毒，2件属于乙型病毒，1件属于丙型病毒。结论：实时荧光定量PCR检验方式有效运用，呈现出有效性以及科学性特点，对于流感病毒核酸检测准确性以及快速性可以做出保证，对于流感病毒流行规律可以进行认真分析，对于公共卫生事件突发可以给予充分预防。

【关键词】流感病毒核酸检测；实时荧光定量PCR；诊断结果

伴随甲型H1N1流感疾病爆发与流行，使流感预防重要意义获得社会广泛关注^[1]。本研究选取2018年1月1日～2020年12月31日的300件流感样病例咽拭子作为研究对象；旨在探讨在实施流感病毒核酸检测中实时荧光定量PCR检验方式运用可行性，为达到预防公共卫生事件突发目标，现报告如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月1日～2020年12月31日，我中心收到的300件流感样病例咽拭子作为研究对象。

1.2 方法

1.2.1 合理进行样本采集

对于所有咽拭子，通过对患者咽后壁以及双侧咽扁桃体进行擦拭，将部分剪去，并且于无菌病毒采样液中进行放置。保存温度为4℃。于实验室尽快送检。对于疑似甲型H1N1病毒，需要对其实施A类包装。

1.2.2 仪器以及试剂

主要利用实时荧光定量PCR仪（STRATAGENE MX3000P）完成检测。将病毒核酸提取试剂盒作为本次研究试剂盒。在进行检测期间，对于试剂盒说明书需要严格参照。

1.2.3 合理进行对应检测

在漩涡振荡器内部将检测标本置入，合理进行充分振荡，并且实施1min处理。对1预装板进行选取，准备蛋白酶K稀释液（1.4mL）在蛋白酶K干粉中加入。观察溶解完全后，分别在第一列以及第七列各准备20μL于每孔加入。后续分别准备200μL标本于每孔加入。在核酸自动提取仪卡槽中准备预装板安置，合理安装磁套，并且将程序启动。完成运行后，将磁套弃掉，并且合理取出预装板。保存温度为-20℃。在Real-timePCR反应体系中，分别准备1μL EnzymeMix、12.5μL 2x-PCR MasterMix以及205μL Rnase FreedH进行加样。分别于上游以及下游完成引物以及探针。均为0.5μL。完成20μL反应体系配置后，准备流感病毒核酸提取液5μL于反应体系中添加。针对样本实施PCR扩增处理。对Ct值进行检测，观察在35以下，并且呈现出S形曲线后，获得阳性检测结果。如未表现出Ct值现象，则证明获得阴性结果。

1.3 观察指标

统计观察各流感病毒核酸阳性结果类型。

2. 结果

对于300件流感样病例咽拭子完成检测后，80件获得流感病毒核酸阳性结果；其中56例属于甲型H1N1病毒，15件属于季节性甲3亚型病毒，6件属于季节性甲1型病毒，2件属于乙型病毒，1件属于丙型病毒。（见表1）

表1 各流感病毒核酸阳性结果类型统计 （n=80）

3、讨论

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，其临床特点为起病急，全身中毒症状明显，如高热、头痛、全身酸痛、软弱无力等，而呼吸道症状较轻。流行性感冒主要通过接触及飞沫传播，传染性强，轻症患者病程短，常呈自限性，重症患者需进行药物治疗，一般可治愈。流行性感冒主要是由于患者被流感病毒感染而引起，主要以空气、飞沫传播为主，人群普遍易感，好发于婴儿、老年人、有基础疾病者、免疫力低下者。

流感作为急性呼吸系统疾病之一，主要因为流感病毒导致患病。其症状以酸痛、高热、呼吸道症状以及乏力为主

^[2]。表现出潜伏期短、流感传染性强、传播迅速特点，主要分为三种类型，分别为甲型、乙型以及丙型。以甲型对人们造成最大程度威胁，对此将流感检测以及防控力度加强，具有重要意义^[3]。

流感病毒呈现出较强致病能力，并且较易表现出变异现象。因为人们针对特异性菌株在必要免疫力方面较为缺乏，从而往往呈现出流行爆发现象，对此将流感防控力度加强，采取有效方法针对流感病毒核酸实施检测，意义显著^[4]。实时荧光定量PCR检测方式有效运用，呈现出显著优势，同普通RT-PCR检测比较，其呈现出更低灵敏度以及更短实验周期特点，并且对于实验室污染可以充分避免。实时荧光定量PCR检测有效应用，其可通过光谱技术敏感性、PCR针对DNA高效扩增以及探针技术特异性展开有效检测，呈现出重复性好、敏感性高优势，并且操作简单、更为直观、容易操作，通过闭管检测，能够将实验室污染发生率显著降低，实用性良好^[5]。

本次研究发现，对于300件流感样病例咽拭子完成检测后，80件获得流感病毒核酸阳性结果；其中56例属于甲型H1N1病毒，15件属于季节性甲3亚型病毒，6件属于季节性甲1型病毒，2件属于乙型病毒，1件属于丙型病毒，从而表明实时荧光定量PCR检验方式有效运用，对于流感类型可以充分明确，从而采取针对性措施展开对应治疗。

综上所述，实时荧光定量PCR检验方式有效运用，呈现出有效性以及科学性特点，对于流感病毒核酸检测准确性以及快速性可以做出保证，对于流感病毒流行规律可以进行认真分析，对于公共卫生事件突发可以给予充分预防。

【参考文献】

[1]包红梅,田国彬,曾显营,等.H10N8亚型禽流感病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2020,42(12):1233-1238.

[2]樊佩佩,赵晓南,伏晓庆,等.2018-2019监测年度云南省流感病毒分子流行病学特征分析[J].现代预防医学,2020,47(21):3846-3850.

[3]何敏,石利民,乔梦凯,等.2014—2016年南京市甲型H3N2流感病毒HA基因的进化分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2020,34(05):490-494.

[4]李艳宇,李姗姗,杜嘉鑫,等.2017—2018年北京市东城区新甲型H1N1流感病毒HA基因特征研究[J].职业与健康,2020,36(20):2834-2838.

[5]杨舒雯.荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果[J].临床研究,2020,28(10):32-33.