人脐带来源的间充质干细胞运载3型呼肠孤病毒在杀伤K562细胞过程中相关细胞因子表达分析

人脐带来源的间充质干细胞运载 3型呼肠孤病毒在杀伤 K562细胞过程中相关细胞因子表达分析

张娟

天津红日金博达生物技术有限公司，天津市， 301700，

摘要:目的：选择具有肿瘤归巢能力的人脐带间充质干细胞（MSCs）作为细胞载体，携带溶瘤病毒3型呼肠孤病毒（Reovirus3）。 研究了细胞培养体系中相关细胞因子对携带呼肠孤病毒3的MSCs杀伤K562细胞的影响，用携带呼肠孤病毒3的K562细胞进行培养，为用细胞因子或支持性携带呼肠孤病毒3的MSCs治疗慢性粒细胞白血病提供了依据。方法：通过体外试验从脐带中分离培养MSCs，对数生长期的MSCs负载呼肠孤病毒3，用对数生长期的K562细胞进行体外细胞培养，分为对照组:K562细胞；MSCs组:K562细胞+MSCs； Revirus3组（阳性对照组）:K562细胞+Revirus3；实验:K562细胞+呼肠孤病毒3+MSCs。细胞共培养24，48，72h，收集各组细胞培养上清液，采用ELISA双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素(IFN)，转化生长因子(TGF)，白细胞介素(IL)-2，IL-4，IL-5，IL-6和IL-17。结果：培养24，48，72h后，MSCs组和实验组TGF，IL-6水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 呼肠孤病毒3组TGF，IL-6水平虽升高，但与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）； 培养48h后MSCs组，Reovi-Rus3组和实验组TNF，IFN，IL-2，IL-4水平虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。 4组培养48h后细胞培养上清中均未检出IL-5IL-17； 4组培养24h和72h后细胞培养上清中均未检出TNF，IFN，IL-2，IL-4，IL-5和IL-17。结论：MSCs携带呼肠孤病毒3在体外测试的细胞培养体系中有效抑制K562细胞，除溶瘤病毒呼肠孤病毒3的溶瘤作用外，还可能与培养体系中的细胞因子有关，细胞因子促进细胞凋亡，从而抑制K562细胞的增殖。

关键词：间充质干细胞；3型呼肠孤病毒；慢性粒细胞白血病；K562细胞

引言

慢性粒细胞白血病(CML)是一种来源于多能造血干细胞的异常增生性肿瘤。

虽然病程较慢，但发病率较高，约占白血病新发病例的10%。 传统疗法治疗CML副作用多，易复发。 尽管分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂的出现与以往相比在CML的治疗效果上取得了重要进展，但酪氨酸激酶抑制剂不能清除处于静息期的白血病干细胞，因此停药后复发是酪氨酸激酶抑制剂治疗CML难以克服的瓶颈，这些困难仍然困扰着许多临床医生和患者。虽然异基因造血干细胞移植有望治愈CML，但由于匹配干细胞来源有限，并发症多，成本高，这种治疗方法难以普及，为此，需要探索免疫疗法等治疗CML的新方法。研究表明，利用MSCs的肿瘤归巢能力可以直接向肿瘤病变提供抗癌基因产物，单独进入体内的溶瘤病毒呼肠孤病毒3可以被体内针对呼肠孤病毒3产生的抗体中和，因此本研究采用具有肿瘤归巢能力的MSC作为呼肠孤病毒3的载体，以逃避体内抗体的攻击，使呼肠孤病毒3到达肿瘤病灶并复制杀死肿瘤细胞。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

K562细胞株(美国ATCC公司);Reovirus3病毒株(贵州医科大学组织工程与干细胞中心);DMEM培养基、RPMI1640培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS,BI公司);磷酸盐缓冲液(PBS,Solarbio公司);ELISA 细胞因子检测试剂盒(安徽巧伊生物科技有限公司);CO2培养箱(Thermo公司)。

1.2方法与步骤

1.2.1细胞的分离与培养参照刘雨思[10]及《细胞培养技术》,通过体外实验从脐带中分离培养MSCs,取第3代处于对数生长期的MSCs进行实验。K562细胞在含有10%FBS的RPMI1640培养基,于37 ℃,5%CO2条件下进行传代培养,取对数生长期的 K562细胞进行实验。

1.2.2分组对照组:K562细胞;MSCs组:K562细胞+ MSCs; Reovirus3组(阳性对照组 ):K562细胞+Reovirus3;实验组:K562细胞 + Reovirus3+MSCs。

1.2.3检测方法分别收集共培养24、48、72h各组细胞培养上清液,1000r/min

离心5min,采用ELISA双抗体夹心法,按照试剂说明书检测肿瘤坏死因子-a(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、

IL-5、IL-6和IL-17水平。培养24、48、72h后培养体系中的K562细胞由本课题组刘雨思[10]进行K562细胞增殖抑制能力检测。

1.3

统计学处理

采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料以

x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步多重比较采用Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 培养24 h时4组细胞培养上清液细胞因子水平比较培养24 h时4组细胞培养上清液均未检测出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。

2.2培养48 h时4组细胞培养上清液细胞因子水平比较培养48 h时MSCs组、R

eovirus3组和实验组TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4水平虽然均高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。培养48h时4组细胞培养上清液均未检测出

IL-5和IL-17。

3 讨论

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成并分泌的具有多种生物学活性的小分子蛋白质,在免疫应答与调节、细胞分化和发育、炎性反应、

组织修复及造血中发挥重要作用。MSCs可分泌多种细胞因子,包括IL-6、IL-7、IL-8、白血病抑制因子、IFN-γ及TNF-α,MSCs具有抗肿瘤免疫调节功能,它的免疫调节功能是通过细胞分泌的可溶性细胞因子,还有细胞与细胞之间受体与配体的相互作用或者两种机制的组合来实现。因此,可以通过检测相应的细胞因子来评价抑瘤体系对白血病细胞溶瘤作用的效果和可行程度。有研究显示,MSCs分泌的细胞因子可促进细胞凋亡,改变 K562细胞的细胞周期分布,这些细胞因可通过BAX和Caspace-3级联途径抑制K562细胞增殖。此外,MSCs分泌的细胞因子IFN可以激活双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)途径,Reovirus3感染 K562细胞后,转录过程中的小基因片段编码的σ3蛋白也可以引起PKR的活化,经IFN及

σ3蛋白激活的PKR可引起细胞凋亡来抑制K562细胞的增殖。

参考文献

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