牛奶中黄曲霉毒素M1的测定能力验证方法研究

牛奶中黄曲霉毒素 M 1 的测定能力验证方法研究

韩世忠

河南金测检测技术服务有限公司 ，河南郑州 450000

摘要 黄曲霉毒素M₁是一种毒性极强的剧毒物质，牛奶是易受黄曲霉毒素M₁污染的食品种类。通过参加能力验证，利用高效液相色谱法对牛奶试样中黄曲霉毒素M₁进行测定。结果表明，在线性系列浓度范围为0.2~4.0 ng/mL时，R²=0.9999；三个添加水平的黄曲霉毒素M₁平均回收率在87.3%~95.5%，能力验证结果显示，两个牛奶测试样品z值分别为-0.1和-0.4，能力验证结果满意，说明该检测方法准确、可靠，适于牛奶中黄曲霉毒素M₁的测定。

关键词 牛奶、黄曲霉毒素M₁、能力验证

中图分类号 S859.3 文献标识码：B

黄曲霉毒素M₁（AFM₁）于1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为I类致癌物质，是一种毒性极强的剧毒物质，牛乳及其制品是易受黄曲霉毒素M₁污染的食品之一^[1]。牛乳中黄曲霉毒素M₁的存在，主要是奶牛食用了受黄曲霉毒素污染的饲料，经乳畜体内羟化酶转化而成^[2]。目前牛乳中黄曲霉毒素M₁的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、免疫亲和柱-荧光光度法、酶联免疫吸附法、双流向酶联免疫吸附法、放射免疫法、免疫胶体金法等^[3]。本文通过能力验证，利用高效液相色谱法对牛奶试样中黄曲霉毒素M₁进行测定，研究方法的准确性和可靠性，以提高实验室的整体检测水平。

1 材料与方法

1. 1. 材料

      1. 样品 测试样品为牛奶，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供（编号21-H977、21-F208）。黄曲霉毒素M₁标准溶液浓度10 μg/mL，由坛墨质检科技股份有限公司标准物质中心提供，证书编号：2622011。

      2. 试剂 甲醇（色谱纯，SIGMA公司），乙腈（色谱纯，SIGMA公司）。

      3. 仪器 高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津），电子天平（FA2004，上海浦春），漩涡振荡器（XE3-WH-2，北京中西），台式高速离心机（TG16WS，湖南迈达），黄曲霉毒素M₁免疫亲和柱（柱容量≥150 ng，安谱实验）。

1.2方法

1.2.1检测方法与统计 参考国标GB 5009.24-2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》第二法；所有数据均使用Excel 2017软件进行统计分析。

1.2.2样品前处理 参考国标GB 5009.24-2016第二法并进行改进。称取4g混合均匀的试样（精确到0.001g）于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋3min。置于4 ℃、6000r/min下离心10 min。取10 mL上清液（相当于2.86g）加40 mL PBS稀释，备用。

1.2.3样品净化 将10 m样液以1-2滴/秒的速度通过L注射器连接于免疫亲和柱上端。将1.2.2步处理好的免疫亲和柱，弃掉流出的液体。加入10 mL水淋洗柱子，弃去流出液。用真空泵抽干免疫亲和柱中水分，加入4 mL乙腈缓慢洗脱，流速控制在2-3秒每滴。收集洗脱液于刻度试管中，在50℃下用氮气吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，旋涡混匀30 s溶解残留物，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于样品瓶中以备进液相检测。

1.2.4液相色谱条件 C₁₈柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm），流动相为水+乙腈（75+25），进样量50 μL，荧光检测器激发波长360 nm，发射波长430 nm，流速1.0 mL/min，柱温箱30℃。

2 结果与分析

2.1标准曲线 为减少溶剂效应，标准物质的稀释液与流动相保持一致。根据测定样品中黄曲霉毒素M₁含量，选择最适的标准线性系列，使待测样液浓度尽可能在线性中间，本实验选择的线性系列浓度范围为0.2~4.0 ng/mL，在该线性系列浓度范围内，黄曲霉毒素M₁标准曲线的线性回归方程为Y=46264x-1118.1，R²=0.9999，说明该标准曲线能够满足牛奶中黄曲霉毒素M₁含量的测定要求，具体标准曲线见图1。

图1 牛奶中黄曲霉毒素M₁标准曲线

2.2加标回收率

根据待测样品中黄曲霉毒素M₁含量，通过设置三个添加水平，计算牛奶中黄曲霉毒素M₁的回收率和相对标准偏差，不同添加水平的回收率见表1。由表1可知，三个添加水平黄曲霉毒素M₁的平均回收率在87.3%~95.5%，其中0.2 μg/kg添加水平的平均回收率最高，0.4 μg/kg添加水平的平均回收率最低。

表1 不同添加水平回收率

2.3 能力验证结果

能力验证结果见表2，从表2可知，样品编号21-H977检测值0.217 μg/kg，指定值0.220 μg/kg，相对标准偏差0.9%，z值为-0.1；样品编号21-F208检测值0.458 μg/kg，指定值0.475 μg/kg，相对标准偏差2.1%，z值为-0.4，能力验证取得满意结果。

表2 能力验证结果

3 讨论

通过对两个牛奶测试样品的测定，黄曲霉毒素M₁在一定线性系列浓度范围内相关系数能够满足定量要求；三个添加水平黄曲霉毒素M₁的回收率在87.3%~95.5%，达到较高水平；能力验证检测结果准确，取得满意结果。表明该检测方法准确、可靠，适用于牛奶中黄曲霉毒素M₁的检测。通过这次能力验证，使我单位检测人员对牛奶中黄曲霉毒素M₁的检测方法有了进一步的认识和掌握，提高了检测人员的技术水平，促进实验室整体检测水平不断提高，增加在同行业中的竞争力。

参考文献

1. 周贻兵,林野,李磊,等.高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M₁的含量[J].食品研究与开发,2014,35(15): 96-98.

2. 刘宝华,高杨. 生鲜乳中黄曲霉毒素检测方法的探索[J]. 中国奶牛,2017,3:40-43.

3. 翟晓瑞,李燕. 乳品中黄曲霉毒素M1残留检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报,2016,7(6): 2309-2313.