116例慢性乙肝患者外周血Septin9基因甲基化检测结果分析

116例慢性乙肝患者外周血 Septin9基因甲基化检测结果分析

党迷 袁平 渠冬菊

克拉玛依市独山子人民医院，新疆克拉玛依 833699

摘要：目的 了解在我院就诊的116例慢性乙肝患者血浆中Septin9基因甲基化水平及阳性率。方法 选自2018年2月至2020年12月我院感染科门诊就诊的50岁以上116例慢性乙肝患者进行外周血Septin9基因甲基化检测。结果发现116例慢性乙肝患者Septin9基因甲基化阳性率为17.24%（20/116），与同期体检中心提供的健康体检者Septin9基因甲基化阳性率2.26%（5/221）比较，结果有显着性差异（P<0.05），文献尚未见该方面的报道。结论 在慢性乙肝患者中开展Septin9基因甲基化检测，旨在通过规范抗病毒治疗的同时，根据 Septin9基因甲基化结果指导患者肠镜检查、随访高危因素如家族史、不健康饮食、有胃肠道症状、运动少、精神紧张、压力过大等，进一步改善或降低其高危因素，降低 Septin9基因甲基化水平，提高乙肝患者治疗效果和健康状况。

关键词：Septin9基因甲基化；慢性乙肝；早期筛查

外周血Septin9基因甲基化检测以其高准确率、方便快捷、无需繁琐肠道准备的过程、体感舒适（非侵入式检测）、绝对安全的前沿科技优势备受广大患者接受，可作为结直肠癌筛查和预后判断的有效指标。我院自2018年1月引进该技术，填补新疆空白，并在结直肠癌早期筛查、诊治、疗效评估及高风险患者中推广应用，本文旨在观察我院感染科门诊及住院部慢性乙肝患者外周血 Septin9基因甲基化水平，根据患者检测结果给提出指导性建议。

目前我国确诊肝病的人数已达全国总人口的1/4，成为名副其实的“肝病大国”，在众多确诊肝病的患者中，有近7,000万人感染乙肝病毒。乙肝病毒感染以后，进入到漫长的慢性乙肝阶段，如果得不到及时、正规的治疗，病情反复的发作，肝脏逐渐发生肝纤维化，进一步发展为肝硬化，甚至诱发肝癌的产生。所以对于慢性乙型肝炎，应该进行积极的抗病毒、保肝护肝等综合性的治疗，阻止或延缓病情的进展，防止出现终末期的肝病^[1]。

1.患者一般资料：

根据慢性乙肝的防治指南（2019版）[1],选自我院2018年1月至2020年12月在感染科门诊及住院部就诊的慢性乙肝患者116例，年龄在51-80岁之间。

2.标本采集与制备：

2.1标本采集：受检者无需禁食水，用K2EDTA抗凝10ml真空采血管（紫帽），抽取患者10ml静脉血，上下颠倒抗凝管5-8次，全血标本2-8℃保存，保存不超过4小时，不能冷冻全血标本。

2.2血浆制备：用DT5-2离心机（无刹车）以1350±150g离心12分钟，将血浆转到一个15ml离心管，再次将装有血浆的15ml离心管1350±150g离心12分钟，吸取3.5ml血浆转到一个新的15ml离心管，-15至-25℃冻存备检[2]。

3检测方法：

3.1样本提取：室温 溶 解 样 本 后 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 提 取。⑴ 裂解：3.5ｍＬ血浆样本、 阳性对照品和阴性对照品中分别加 入3.5ｍＬ裂解吸附液，涡旋混匀后放置10ｍｉｎ；⑵ＤＮＡ结合： 依次将磁珠和无水乙醇添加到１５ｍＬ离心管中， 置于旋转混匀器上中速旋转45 min；⑶ＤＮＡ 洗涤： 用洗液Ａ洗涤后祛除残余液体；(4)洗脱：加入洗脱液重悬磁珠， 并将全部洗脱液移至新离心管中。
3.2亚硫酸盐转化:步骤：⑴ 在含有DNA 洗脱液的离心管中加入亚硫酸盐溶液和保护液， 涡旋混匀反应液，80 ℃ 恒温孵育45min；⑵ 结合：在离心管中依次加入洗液Ａ和磁珠，涡旋混匀,1000ｒ／min， 孵育45min；⑶洗涤：分别用洗液Ａ和洗液Ｂ洗涤并去残余液体；(4)干燥和洗脱：室温静置10min待沉淀干燥后加入60μＬ 洗脱液，涡旋混匀重悬磁珠。1000ｒ／min 孵育10min，置于DynamagＴＭ－２磁性架６min， 将洗脱液（ 约60μ）转移至新的离心管中。
3.3 基因扩增:将30μlPCR预反应液加至96 孔培养板。 加30μＬ的BisDN至ＰＣＲ 板对应的孔中，5000ｒ／min离心５ｓ（ｒ＝14ｃｍ）， 置于扩增仪对应样品槽中， 按对应的顺序设置待测样本。 扩增程序：94 ℃ ２０ min；
62 ℃ ５ｓ；55.5 ℃ 35ｓ； 93 ℃ 30ｓ；40 ℃ ５ｓ；93 ℃30ｓ→62 ℃ ５ｓ， 45个周期（ 55.5 ℃采集FAM和HEX荧光）^[2]。

2.4结果判断：⑴Septin9甲基化检测阳性：CT≤ 41.1， ACTB的CT≤32.1；⑵ Septin9甲基化检测阴性：无CT值或CT＞41.0， ACTB的CT≤ 32.1；⑶ 检测结果应同时达到上述要求，且扩增曲线无异常， 否则实验无效。

4.结果：统计116例Septin9基因甲基化检测结果，阳性20例，阳性率17.24%（20/116）。

5.结论：

我院就诊的慢性乙型肝炎患者 Septin9基因甲基化检测结果高于健康体检者，其机理尚不清楚，也未见文献报道。在慢性乙肝患者中开展Septin9基因甲基化检测是有必要的，阳性患者嘱咐其预约肠镜进一步检查，肠镜有问题的，根据肠镜和病理结果进一步治疗，肠镜没问题的，随访其高危因素，降低高危风险，改善饮食习惯，减少熬夜和焦虑情绪，适量运动，养成良好的生活、饮食习惯，以清淡、易消化、低脂、高纤维素的食物为主，多吃水果蔬菜，保持食物的新鲜、营养，同时保持心情愉悦，舒畅，同时需忌烟酒、忌辛辣刺激、油炸食物。乙肝病人的饮食原则，主要是根据病情进行合理膳食。例如在乙肝的稳定期，一般在饮食上没有什么特别需要注意的，但是不能饮酒，可以尽量要多食富含优质的蛋白质、脂肪、维生素以及微量元素等的食物，如可以多食鸡、鸭、鱼肉以及新鲜的蔬菜水果等等。但是如果肝炎已经发展成肝硬化，并且出现了门静脉高压时，饮食要细软，不能食用带有骨头鱼刺之类的食物。而出现肝昏迷的病人不宜食用肉蛋等高蛋白食品，否则会引起氨中毒，加重肝昏迷的症状，此时的饮食需要低脂低盐的流质或半流质食物。三个月或半年复查 Septin9。Septin9适检人群（症状）：常有腹泻，大便变扁、便秘、腹部不适、便血等症状；不明原因的缺铁性贫血、消瘦、乏力等患者；不明原因的肠梗阻、腹部肿块、腹痛等；对有慢性结肠炎、结肠腺瘤性息肉，特别是家族性结肠息肉病患者； 长期食用高脂肪、高蛋白、低纤维食物的人群；精神紧张、压力过大、运动量少的人群；所有50岁以上的人群；有家族史的患者。血液Septin9甲基化检测总体灵敏度76.63%， 特异性95.93%^[2]。

Septin9甲基化对肿瘤的早筛、复发及转移具有较好的提示作用，术后Septin9甲基化的状态可能直接提示患者是否存在隐匿性肿瘤细胞，并预测术后疾病复发可能。Septin9基因异常甲基化不仅发生在结直肠癌, 也发生在乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌症、白血病和淋巴瘤等。基因芯片结果显示, Septin9在乳腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中高表达, 在鼠的肝癌中Septin9也是高表达的, 在转移癌细胞系中含量丰富, 研究证实其高表达能促进转移, 而这跟微管和肌动蛋白有关。同时在上皮源性肿瘤及其侵袭的相邻组织和转移形成中常常观察到细胞间的粘附力和细胞极性的缺失, 但其作用仍然不清楚^[3]。

参考文献：

[1] 慢性乙型肝炎防治指南（2019年版），中华医学传染病杂志2019,37（12），711-736.

[2] Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书.

[3] 张苗苗，余辉，陈庆.Septin9基因在肿瘤中的研究进展，国际检验医学杂志.2019,40(04),453-458.