污泥中的厌氧微生物群落结构及抗生素抗性基因

污泥中的厌氧微生物群落结构及抗生素抗性基因

张鑫 1,2,3,4*，张宝强

1.陕西省土地工程建设集团有限责任公司，西安 710075； 2.陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司，西安 710075； 3.自然资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室，西安 710075； 4.陕西省土地整治工程技术研究中心，西安 710075

摘要：污水处理厂中抗生素的来源包括人们的日常使用，畜牧业、水产养殖业以及医疗和制药过程中药物残留及排放，而抗生素的存在会诱导产生抗生素抗性基因（ARGs），这使得污水处理厂特别是活性污泥成为巨大的抗性基因库。ARGs通过基因水平转移扩散到病原微生物会威胁人类健康。

污泥作为污水处理厂的主要副产物，其产量在2017年已达4.328×10⁷t(含水率80%计)^[1]。剩余污泥一般含有大量有机物、重金属和病原体，若未得到妥善处置将严重威胁环境。目前，有多种技术可对污泥进行资源化利用，如燃烧、热解和厌氧消化^[2]，其中厌氧发酵是污泥资源化利用的重要途径。

1.污泥中常见的厌氧微生物群落分布

污泥在厌氧消化过程中主要涉及水解酸化细菌和产甲烷古菌。其中，水解酸化细菌在污泥厌氧消化过程中发挥作用。水解细菌能将污泥中的碳水化合物、蛋白质和脂质转化为简单的溶解性单体物质，酸化细菌能将水解产物进一步转化为酸性产物（挥发性脂肪酸），从而为微生物的生长提供碳源。显然，细菌不仅对污泥中有机物的水解和酸化起关键作用，而且还会影响厌氧消化的效率。以往的研究发现，古菌在厌氧体系中约占微生物总量的10%^[3]。细菌在微生物总量中所占比例高于古菌，所以细菌群落结构的变化会影响古菌群落^[4]。根据Ahring的报道，厌氧微生物至少涵盖了20个门的细菌，包括变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、螺旋体门(Spirochaetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)等。在上述菌群中，Bacteroidetes和Firmicutes是水解过程中主要的菌群；Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是酸化过程中主要的菌群^[5]。可见，Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes群落的变化对厌氧消化体系产生重要影响，这是因为它们是厌氧消化过程中的主要门分类^[6]。

在厌氧消化过程中，水解和酸化阶段均有细菌参与，而产甲烷阶段完全由古菌参与。产甲烷代谢途径的本质是产甲烷菌利用细胞内一系列特殊的酶和辅酶将CO₂或甲基化合物中的甲基通过一系列的生物化学反应还原成甲烷。产甲烷菌根据产甲烷途径主要分为三种类型，即乙酸型、氢型和甲基型产甲烷菌。其中，大多数的甲烷主要是通过乙酸型和氢型产甲烷菌作用所产生。以往的研究发现，甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷丝菌属(Methanosaeta)和甲烷微菌属（Methanomicrobium）是主要的产甲烷微生物。除上述菌属外，在厌氧反应器中还会检出Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae、甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷螺菌属(Methanospirllum)、Methanoculleus和Methanomassilliicoccus。其中，Methanosarcina和Methanosaeta均属于乙酸型产甲烷菌。Methanosarcina属于多功能的产甲烷菌，即具有乙酸型产甲烷菌的能力，又具有氢型和甲基型产甲烷菌的能力；故Methanosarcina能利用乙酸、甲醇、甲胺、二甲胺和H₂/CO₂产生甲烷^[7]；且Methanosarcina也是唯一一种能通过上述三种途径产生甲烷的菌种。同时，Methanosarcina对挥发性脂肪酸(VFAs)和有机承载率(OLR)具有较高的承受能力。在厌氧环境下，随着乙酸浓度的变化会使得Methanosarcina和Methanosaeta丰度发生变化。以往的研究表明，高浓度的乙酸环境适于Methanosarcina生长，而低浓度乙酸适于Methanosaeta生长。近年的研究也发现，当乙酸浓度在250~500mgCOD/L时，Methanosarcina为主要菌种^[8]。

2.污泥中的抗生素含量

由于人类的抗生素使用量日益增大，废弃药物的丢弃和人体代谢物的排放成为污水处理厂中抗生素的主要来源。研究结果表明市政污水中抗生素的浓度为0.98ng/L~0.915μg/L。兽用抗生素在现代畜牧业和水产养殖业中不可或缺，其在动物疾病预防和治疗、生长促进以及提高饲料利用率等方面具有显著作用。兽用抗生素的广泛使用导致其在污水处理厂进水中检测出的浓度较高，达到1.72ng/L~2.17μg/L。医疗和制药废水是污水处理厂中抗生素的主要来源。人工合成获取的抗生素不能被完全提取，导致废水中通常会残留一定量的抗生，医药企业的处理工艺对抗生素去除能力有限，使得大量残留抗生素随制药废水进入污水处理厂。有研究发现医院废水中抗生素浓度为1.14ng/L~11.8μg/L，而制药废水中抗生素浓度相对较高，有的甚至高达92.20mg/L。总体来说，不同来源抗生素进水浓度由高到低依次为:制药厂>医院>畜牧养殖场>市政污水。常见抗生素在污水处理厂进水中浓度由高到低为：四环素类>磺胺类>β-内酰胺类>喹诺酮类>大环内酯类；出水浓度由高到低为：四环素类>磺胺类>大环内酯类>β-内酰胺类>喹诺酮类；污水处理厂对抗生素的去除率由高到低为：β-内酰胺类>喹诺酮类>磺胺类>四环素类>大环内酯类。喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类抗生素会存在负去除现象

^[9]。

3.污泥已成为环境中重要的ARGs库源

污水处理厂每天接收和处理成千上万吨来自于人类生活污水、医疗废水、工业废水和养殖废水等污水，人类粪便、动物排泄物、制药厂出水以及医院出水中含有大量的抗生素抗性细菌(Antibioticresistantbacteria，ARB)和抗生素抗性基因，这些污水汇聚到污水处理厂，使污水处理厂尤其是活性污泥成为巨大的抗性基因库。其次，活性污泥也是抗性基因水平转移的热区，不同来源的高度多样化的细菌在适宜的温度、丰富有机质、选择压力(如抗生素，重金属，药物，杀菌剂)等条件下，形成生物团聚体和生物膜，抗性菌与非抗性菌相互作用，使得非抗性菌可以通过水平基因转移获得抗性基因。在实际污水环境中，对抗性基因产生选择压力的化合物的浓度远低于临床治疗浓度，但是即使在最小抑制浓度水平甚至最小抑制浓度1/50或1/100倍，这些化合物仍然对微生物抗性表型具有选择压力。多数研究关于化合物对抗性选择压力的研究主要集中在简单体系中，对于实际污水体系中的化合物对抗性选择压力研究还需深入研究。最后，由于目前污水处理工艺还不能完全去除污水环境中的抗性菌和抗性基因，出水中依然残留一定数量的抗性基因，这些抗性基因随出水排放从而扩散到下游自然环境中，例如河流、湖泊、海洋、土壤等，从而污染下游环境^[10]。基于此，污水处理厂(活性污泥)是人类活动和环境之间一个独特界面，在抗性细菌和抗性基因在环境中的发生、扩散与持续存在方面发挥着重要作用。

4.群落结构对消化功能稳定性的影响

描述微生物群落结构对扰动期间和扰动后厌氧功能稳定性影响的方法已经过审查。这些方法包括Hashshan等人的工作得出的结论是，在同一营养组内具有多种微生物的厌氧消化器群落（即更多的并行处理）在有机过载后表现出更大的功能稳定性。功能稳定性表面上是因为一种或多种微生物存在并且能够在扰乱期间和之后在每个关键组中发挥作用。此外，不稳定的群落结构（即更大的群落灵活性）可能会增加扰动时的功能稳定性，因为不稳定的群落更能适应压力。已发现具有较高均匀度的社区比不均匀的社区在功能上更能抵抗选择性压力。在这方面，与低均匀度的社区相比，当暴露于盐毒性时，具有更高均匀度的反硝化群落表现出更高的反硝化率。尽管产甲烷系统不是他们的重点，但结果可能适用于厌氧消化器；该理论认为，在高度均匀的社区中，一种或多种对压力有抵抗力的生物体以足够多的数量存在以增殖和维持功能的可能性更高。

5.群落结构、产甲烷活性和线性关系

研究了微生物群落结构对无扰动操作过程中产甲烷活性的影响。在对9个处理啤酒废水的全尺寸消化器进行的多年调查中，具有更高均匀度和冗余度的社区表现出更高的特定产甲烷活性(SMA)值和更高的COD去除率。此外，更高的acteroidetes和古细菌丰度已被证明与更高的水解和产甲烷比活性相关，特别是。在我们的实验室中，Tale等人。(2011)测量了来自全规模厌氧消化器的14种不同生物质样品的SMA与丙酸盐的关系，还比较了微生物群落。主成分分析(PCA)描述了SMA与丙酸盐和微生物群落结构之间的线性关系，该结构由甲基辅酶M还原酶(mcrA)的变性梯度凝胶电泳(DGGE)条带模式定义，该基因在产甲烷菌中普遍存在。具有高SMA值的生物量聚集在仅使用DGGE条带模式开发的PCA图上，而具有低SMA值的生物量聚集在不同的位置。此外，氢营养型产甲烷菌的存在与Methanospirillum和Methnobacterium密切相关，与高丙酸SMA值相关。建立在这项工作以及Freitag和Prosser(2009)、Morris等人的工作的基础上发现一组四种不同富集培养物中的mcrA基因拷贝数与具有H₂/CO₂的SMA线性相关0.98。

参考文献

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