基于网络药理学研究川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的机制

基于网络药理学研究川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的机制

邹常超 1 周海燕 2 莫丽莉 2 徐启丽 2 李伟 2 刘兴德 1 3

1.贵州中医药大学 贵州 贵阳 550000

2.贵州医科大学附属医院心血管内科 贵州 贵阳 550000

3.贵州中医药大学第二附属医院心血管内科 贵州 贵阳 550000

摘要：目的:基于网络药理学研究方法探究川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法:运用TCMSP数据库收集药物的活性成分并进行筛选，利用SwissTargetPrediction数据库检索活性成分的靶点，利用GeneCard数据库和OMIM数据库检索疾病靶点，将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集得到药物作用于疾病的目标靶点，利用STRING数据库绘制靶点蛋白相互作用网络，通过富集分析预测作用机制。结果:筛选出川芎的活性成分7个，潜在治疗靶点86个，主要治疗靶点8个。蛋白互作分析结果显示，59个靶点存在相互作用关系。GO富集分析主要涉及氧化应激，炎症反应等，KEGG通路富集分析主要涉及神经活性配体-受体相互作用通路、PPAR信号通路、花生四烯酸代谢通路。结论:川芎通过多成分，多靶点，多通路作用于心肌缺血再灌注损伤。

心肌缺血再灌注损伤是当心肌细胞在低灌流缺血后获得血液再供应时，不但未减轻心肌细胞缺血性损伤，反而加重其损害的一种现象。心肌缺血再灌注损伤是引起急性心肌梗死的重要因素之一，其确切的机制至今尚不明确，但现如今的研究表明其发生机制与氧化应激反应、钙离子超载、炎症反应和线粒体形态功能障碍等有关[1-3]。目前西医尚未有特效药治疗，只能对症治疗，但疗效欠佳；而中医药依据其独特的理论，在治疗心肌缺血再灌注损伤方面有着很好的疗效。

根据心肌缺血再灌注损伤的临床症状和病位，现代中医医家将该病归为“胸痹”，“真心痛”等范畴，胸阳不振，阴寒凝结，气滞血瘀是该病的常见病理机制[4, 5]。中药川芎，为伞形科植物川芎的干燥根茎，味辛温，具有活血行气，祛风止痛之功效。川芎为血中之气药，为气滞血瘀证的要药。现代中药药理研究发现，川芎具有抑制炎症反应，抑制氧化应激，抗凝，保护缺氧细胞等多种药理作用，并且能够减轻心肌缺血再灌注损伤，保护心肌细胞[6, 7]。因此，选用网络药理学探究川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的主要药效物质和作用机制，为川芎的临床研究提供新的思路和方法。

2.材料与方法

2.1药物主要活性成分及潜在靶点筛选

在TCMSP数据库中检索中药川芎的化学成分,设置口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%,类药性(drug-likeness,DL)≥0.18为筛选条件，即得到川芎的活性成分[8]。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)获取有效成分的Canonical SMILES序列,在Swiss Target Prediction[ⁱ] (http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中进行检索，获得川芎的活性成分靶点。

2.2心肌缺血再灌注损伤靶点的获取

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/)和OMIM（http://omim.org/)中，以"myocardial ischemia reperfusion injury"为关键词进行搜索获取MIRI相关的靶点基因。

2.3川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在作用靶点的获取

将川芎活性成分的靶点和心肌缺血再灌注损伤相关靶点取交集得到的靶点，为潜在作用靶点。

2.4川芎活性成分—靶点网络构建

将筛选出的药物活性成分和2.3中得到的药物作用于疾病的潜在靶点分别导入Cytoscape3.6.1软件,构建"药物-成分-疾病靶点"相互作用网络,并分析药物中的主要活性成分。

2.5蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点导入STRING(https://string-db.org/)数据库,设置置信度分数score>0.9，其余参数默认不变,得出的蛋白作用信息。

2.6通路富集分析

利用 David 数据库( https://david.ncifcrf.GOv/)对潜在作用靶点进行 GO 功能和KEGG 通路富集分析。

结果

3.1川芎活性成分及其潜在靶点

本研究在TCMSP数据库中检索到川芎成分189个，经口服利用度（OB）大于30%和类药性（DL）大于0.18的条件筛选，得到7个活性成分（见表1）。运用PubChem数据库和Swiss Target Prediction数据库共找到这7个活性成分的90个潜在靶点。

表1.川芎活性成分

3.2心肌缺血再灌注损伤相关靶点及潜在作用靶点

利用OMIM数据库和GeneCards数据库检索MIRI疾病相关靶点，去重后共得到1278个靶点。使用活性成分的靶点与疾病的靶点取交集共得到药物与疾病共同靶点36个。

3.3 药物-成分-疾病靶点网络构建和拓扑分析

将筛选得到的7个药物活性成分和6个潜在治疗靶点相关文件导入Cytoscape3.6.1软件，绘制药物-成分-疾病靶点网络图。使用Network Analyzer 功能分析得到平均最短路径长（average shortest pathway length , ASPL），节点的度值，中间中心性（betweeness centrality, BC）等拓扑参数。在该网络图中，度值最大的活性成分可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的关键成分，为亚油酸乙酯（度值=8）。

3.4 PPI网络构建和拓扑分析

在STRIN数据库中导入36个药物-疾病共同靶点,设置置信度分数score>0.9，余参数不变,将得到的PPI网络关系数据以导入Cytoscape软件进行分析。网络中有35个节点，23条边。其中度值最高的5个靶点是PTGS1,PTGS2,ALOX5,CYP2B6,CYP2C19,推测川芎主要通过这些交集靶点作用于心肌缺血再灌注损伤。

3.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

在David数据库导入36个药物-疾病共同靶点，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析结果显示在GO功能富集分析过程中，共确定了132个GO条目，包括多细胞的环氧合酶途径、药物反应、炎症反应的调节、活性氧代谢的调控、氧化还原过程、血压调节等81条生物过程；血红素结合、酶结合、类固醇激素受体，胆固醇结合、蛋白酶活性等35个分子功能；细胞器膜、内质网膜、核染色质、膜结合细胞器等16条与细胞组成相关功能。KEGG通路富集分析结果表明有7条代谢通路与川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的分子机制有关：花生四烯酸代谢通路，PPAR信号通路，神经活性配体-受体相互作用通路，5-羟色胺能突触，胆汁分泌，补体与凝血级联，氮代谢。结果表明这7条代谢通路主要富集于信号传递，免疫系统，内分泌系统，炎症反应，代谢、神经系统等。

讨论

网络药理学通过大数据处理分析，能够系统的全面的分析药物作用机制及疾病治疗的靶点，为临床新药的研究和疾病的治疗提供了新的研究方法和思路。本研究运用该方法探究川芎作用于心肌缺血再灌注损伤的机制，得到川芎的7个活性成分，以及36个潜在治疗MIRI的靶点。说明川芎可以通过多靶点，多成分作用于心肌缺血再灌注损伤。

潜在治疗靶点的蛋白相互作用网络分析表明，21个靶点之间存在着相互作用，其中这5个靶点在蛋白相互作用中度值最高，这些靶点分别是：PTGS1,PTGS2,ALOX5,CYP2B6,CYP2C19。以上结果表明川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的靶点之间是相互调节，共同参与，而不是单独作用的。

KEGG通路富集结果表明，川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的关键靶点主要涉及花生四烯酸代谢通路，PPAR信号通路，神经活性配体-受体相互作用通路，5-羟色胺能突触，胆汁分泌，补体与凝血级联，氮代谢这7条途径。PPAR信号通路参与能量代谢，炎症反应等病理生理过程，体内外研究显示可以通过调节PPARG和UCP2途径，减轻心肌细胞缺血再灌注损伤，保护心肌细胞[9]。花生四烯酸代谢通路主要调控炎症反应，其各种代谢途径与心血管疾病的发展密切相关，各种代谢物均参与缺血再灌注损伤[10]。因此，川芎可能通过多途径作用于心肌缺血再灌注损伤。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，系统地描述了川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的作用机制，筛选出了多个川芎的活性成分，以及这些成分作用的靶点及通路。这些研究结果为后续研究川芎治疗心肌缺血再灌注损伤的机制提供了新的方向，以期更加全面地阐述川芎这味中药的药理作用；为开发川芎新的临床药物提供可能。

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作者简介：邹常超 贵州中医药大学 2019级在读研究生

通讯作者：周海燕 Emai:zhouhaiyan12388@126.com 刘兴德Email:lxd@gmc.edu.cn

国家自然科学基金：82060855,31760294；贵州省科技厅基金：黔科合基础[2016]1120，黔科合基础[2018]1137黔科合平台人才[2018]5608，黔科合平台人才[2018]5779-38；贵阳市科技局：筑科合同[2017]5-14，筑科合同[2017]30-10；贵州省教育厅青年科技人才成长项目：黔教合KY字[2018]182