白肉火龙果果皮中果胶酶的提取及其酶学性质

袁楚玲

廉江市检验检测中心 524499

摘要：将新鲜并且表面无病斑的白肉火龙果进行果皮与果肉分离，用不锈钢小刀将果皮切成小块，放入预冷的研钵中冰浴研磨，加入约为果皮5倍体积的pH8.0 Tris-HCl缓冲溶液，均匀搅拌后纱布过滤，取滤液4℃ 8000rpm离心10min后，取上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至35%饱和度盐析沉淀24h，4℃ 8000rpm离心20min取上清液，再向上清液中加入固体硫酸铵至65%饱和度盐析沉淀24h，4℃ 8000rpm离心20min取沉淀，所得固体回溶后进行透析，透析后溶液即为本实验所需白肉火龙果中的果胶酶酶液，检测酶的活性，进一步检测其最适温度、最适pH、米氏常数以及几种离子对酶活的影响。

关键词：火龙果 果胶酶 提取 酶学 性质

1引言：果胶酶是一种复合酶。它是多种酶的总称，可以将果胶分解成半乳糖醛酸等物质，在食品工业、麻料脱胶、木材防腐和水果与农副产品加工等方面有着广泛的应用。但果胶酶在生产方面普遍采用的是菌体发酵的方法获取酶制剂。在大自然中，普遍植物本身就含有果胶酶，所以在本次实验中，所用材料为白肉火龙果，通过盐析和透析所得酶液后，采用DNS的方法对其酶学性质进行研究，研究得出白肉火龙果果胶酶的酶活性，最适温度，最适pH，米氏常数以及几种常见金属离子对其的影响。

2.材料与方法

2.1试剂和仪器

三羟基甲基氨基甲烷、盐酸、硫酸铵、柠檬酸、磷酸氢二钠D-半乳糖醛酸、果胶、酒石酸钾钠、DNS、苯酚、无水亚硫酸钠

白肉火龙果：新鲜上市表面无病斑的白肉火龙果果皮

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液：pH5.0

D-半乳糖醛酸溶液：1.00mg/mL

果胶溶液：10mg/mL

高速离心机

水浴锅

2.2方法

2.2.1酶液的提取方法

2.2.1.1材料处理

将白肉火龙果果皮（约一只火龙果的一半），用蒸馏水清洗干净，用不锈钢小刀将果皮切成小块，放入预先冷浴的研钵中研磨，然后加入约为果皮体积的5倍体积的pH8.0 Tris-HCl缓冲溶液，搅拌均匀后，用纱布过滤，取滤液，4℃ 8000rpm，离心10min，上清液即为果胶酶粗提液。

2.2.1.2分离纯化

上述所得粗提液缓慢加入固体硫酸铵至35%饱和度（19.4g/100mL）,冰箱中盐析过夜后，4℃，8000r/min，离心20min，测量上清液体积。

缓慢加入固体硫酸铵至65%饱和度（18.4g/mL），冰箱盐析过夜后，4℃，8000r/min，离心20min，所得沉淀回溶后，装入透析袋中，冰箱中透析过夜，所得溶液即为果胶酶溶液。

2.2.2标准曲线制作

称取0.10g D-半乳糖醛酸，用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液定容至100mL，即为1.00mg/mL的D-半乳糖醛酸溶液，取9支25mL比色管，编号，按D-半乳糖醛酸溶液/(mg/mL)0mL加蒸馏水共4mL，并按D-半乳糖醛酸溶液0.2mL递增9个梯度，沸水浴5min，立即流水冷却，摇匀，在540nm下测吸光值。

2.2.3果胶酶活力测定

2.2.3.1酶活力单位

1g或1mL酶液在50℃ pH5.0条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

2.2.3.2酶活力测定步骤

取4支25mL比色管，编号，分别向1、2号加入果胶底物，在50℃水浴中预热5min后，分别加入1mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，再分别加入1mL酶液，1号管在50℃水浴30min，2号管立即沸水浴5min终止反应，冷却。

分别取1、2号管中反应液2mL于3、4号管中，再分别加入2mL蒸馏水，5mLDNS，混合，沸水浴5min，流水冷却后，加蒸馏水定容至25mL。

将溶液转到离心管中，6000r/min，10min，取上清液，去离子水空白调零，540nm测吸光值。

酶活力计算：X =(A₃ – A₄)*N*3.5/（K * t），（式中：A₃：酶样吸光度；A₄：酶空白样的吸光度；N：酶液稀释倍数；3.5：取了反应液的2/7；K：标准曲线斜率；t：反应时间, h）

2.2.4火龙果果胶酶酶学性质

2.2.4.1果胶酶的最适温度

取5支25mL比色管，编号，加入试剂后，在各温度下准确水浴30min后，立即沸水浴5min终止反应，流水冷却，摇匀。

从上述各管中分别取出2mL反应液于另外5支25mL比色管，分别加入2mL蒸馏水，5mLDNS后，沸水浴5min，冷却摇匀，分别转到离心管中，6000r/min，离心10min，取上清液，以去离子水做空白，在540nm下测吸光值。

通过比较吸光值的大小确定酶最适温度。

2.2.4.2果胶酶的最适pH

取5支25mL比色管，编号，加入试剂后，在各pH下50℃准确水浴30min后，立即沸水浴5min终止反应，流水冷却，摇匀。

从上述各管中分别取出2mL反应液于另外5支25mL比色管，分别加入2mL蒸馏水，5mLDNS后，沸水浴5min，冷却摇匀，分别转到离心管中，6000r/min，离心10min，取上清液，以去离子水做空白，在540nm下测吸光值。

通过比较吸光值的大小确定酶最适pH。

2.2.4.3米氏常数的测定

在pH3.8 0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中，50℃,保温30min，不同果胶浓度（2.0~10.0mg/ml），测定酶活力，双倒数作图求Km和Vmax。

取5支25mL比色管，编号，加入试剂后，50℃准确水浴30min后，立即沸水浴5min终止反应，流水冷却，摇匀。

从上述各管中分别取出2mL反应液于另外5支25mL比色管，分别加入2mL蒸馏水，5mLDNS后，沸水浴5min，冷却摇匀，分别转到离心管中，6000r/min，离心10min，取上清液，以去离子水做空白，在540nm下测吸光值。

通过吸光值计算得出酶活力，双倒数作图得出Km和Vmax。

2.2.4.4几种常见金属离子对酶活影响

取6支25mL比色管，编号，加入试剂后， 50℃准确水浴30min后，立即沸水浴5min终止反应，流水冷却，摇匀。

从上述各管中分别取出2mL反应液于另外6支25mL比色管，分别加入2mL蒸馏水，5mLDNS后，沸水浴5min，冷却摇匀，分别转到离心管中，6000r/min，离心10min，取上清液，以去离子水做空白，在540nm下测吸光值。

通过比较吸光值的大小，判定各离子对酶活的影响。

3. 结论：本次实验得出，白肉火龙果果胶酶的最适温度为50℃，最适pH为3.8，米氏常数Km为69.27mg/mL，Na⁺对果胶酶水解果胶的能力没有影响，Mg²⁺、Zn²⁺ 和Cu²⁺对果胶酶水解果胶有抑制作用，Fe²⁺对果胶酶水解果胶有促进的作用。

参考文献：

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