关于头孢氨苄胶囊微生物计数法的建立

关于 头孢氨苄胶囊微生物计数法的建立

1 陆建足 2 张正关

重庆科瑞制药（集团）有限公司 重庆 400060

摘要：微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数^[1]，主要项目包括需氧菌计数、霉菌及酵母菌计数。按照《中国药典》的规定：任何药品进行微生物计数时，所选方法的适用性须经确认；其要求是摸索建立方法时各试验菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌、黑曲霉菌）的回收率值应在50%至200%，才可以确认采用该方法对头孢氨苄胶囊微生物计数具有适用性。

关键词：平皿法；薄膜过滤法；酶；回收率

引言：微生物计数法主要包含有常规法和薄膜过滤法两种。如果供试品本身具有抗菌活性，应尽可能去除或中和，从而真实反应出药品所含微生物的数量，使其控制在规定范围内。头孢氨苄胶囊属于β内酰胺类抗生素(须使用头孢菌素酶破坏其β内酰胺环从而消除其抑菌性)，它是第一代口服的头孢菌素，一种广谱的抗菌素类药，主要是通过抑制细菌细胞壁的合成，从而发挥抗菌的活性，主要是用于革兰氏阳性菌和阴性菌的感染。此验证为该药品微生物计数检验提供一定参考，具体报告如下：

1 仪器、试药试剂与菌种清单

1. 1. 仪器

VAC0712A25VF空气调节机组；生物安全柜；SHH-250L型生化培养箱；YG-0.36型、YG-0.2型脉动真空灭菌柜；移液枪等。

1. 2. 试药试剂清单

培养基：pH7.0氯化钠-蛋白胨（批号：210223）、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）、胰酪大豆胨琼脂(TSA)、胰酪大豆胨液体(TSB)、沙氏葡萄糖液体(SDB)；均购自北京三药科技有限公司。

头孢菌素酶；购自杭州北望生物科技有限公司。

冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液；购自海博生物科技有限公司。

1.3 菌种：由中国食品药品检定研究院提供铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉。

2 方法

2.1菌液制备

取经33℃培养18h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的TSB培养物分别用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释成适宜浓度的菌悬液； 取经23℃培养2天的白色念珠菌SDB培养物用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释成适宜浓度的菌悬液；取经23℃培养7天的黑曲霉菌SDA斜面培养物，加入3～5ml含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液洗下霉菌孢子，吸取出菌液用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

2.2 供试液制备

供试品名称：头孢氨苄胶囊；来源：重庆科瑞制药（集团）有限公司；规格：0125g。

取供试品10g，加入温度为38℃~40℃的100ml灭菌pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，摇匀后制成浓度为 1：10供试液；

2.3 方法验证试验

根据其抗菌谱，首先选用金黄色葡萄球菌进行需氧菌代表进行预试验，采用方法为常规法和薄膜过滤法；选用白色念珠菌进行霉菌及酵母菌代表进行预试验，采用方法为常规法；待其回收率符合要求后，需氧菌总数计数中其余菌株则按照金黄色葡萄球菌符合规定的验证方法进行验证，霉菌及酵母菌中黑曲霉菌株则按照白色念珠菌符合规定的验证方法进行验证。

2.3.1平皿法

（1）试验组：取1：10供试液9.9ml，加入试验菌液0.1ml摇匀后使每1ml含菌量不大于100cfu，取1ml注入平皿，立即倾注相应培养基(需氧菌使用TSA培养基，且每200ml含200万单位头孢菌素酶；霉菌及酵母菌使用SDA培养基)，每株试验菌平行制备2个平皿，培养之后按平皿法计数。

（2）供试品对照组：取上述供试液，以稀释液代替试验菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组：取试验菌液0.1ml加入9.9mlpH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，使每1ml含菌量不大于100cfu，混匀，取1ml注入平皿，立即倾注相应培养基(需氧菌使用TSA培养基，且每200ml含200万单位头孢菌素酶；霉菌及酵母菌使用SDA培养基)，每株试验菌平行制备2个平皿，培养之后按平皿法计数。

2.3.2 薄膜过滤法 (冲洗3次)

（1）试验组：取1：10供试液2ml至50ml无菌 pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，摇匀后全量注入半封闭集菌器中过滤完全，用0.1%无菌蛋白胨水溶液300ml分3次冲洗滤膜，100ml/次，流速120ml/min，在最后一次的冲洗液中加入1ml菌液（含菌量不大于100cfu）摇匀过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA培养基（每200ml含200万单位头孢菌素酶）平板上，培养之后进行计数。

（2）供试品对照组：取上述供试液，以稀释液代替试验菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组：取100mlpH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液注入半封闭集菌器，再加入1ml菌液（含菌量不大于100cfu）过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA（每200ml含200万单位头孢菌素酶）平板上，培养之后进行计数。

根据以下公式计算回收率：

预试验结果 表1

结果分析：采用1：10平皿法（培养基加酶）对金黄色葡萄球菌进行回收率试验时，回收率为0，呈现出完全抑菌状态；采用薄膜过滤法（1：10取2ml冲洗3次）时金黄色葡萄球菌回收率为106.7%，达到50%~200%；采用平皿法（1:10）对霉菌及酵母菌中白色念珠菌进行回收率试验时，回收率为105.5%，达到50%~200%。据此，可采用金黄色葡萄球菌和白色念珠菌合格的方法对需氧菌（薄膜过滤法）和霉菌及酵母菌（平皿法）其他菌株进行试验。

试验结果 表2

结果分析：不管是采用平皿法（1:10）对霉菌及酵母菌中黑曲霉进行回收率试验，还是采用薄膜过滤法（1：10取2ml冲洗3次）对需氧菌其它菌株进行回收率试验，回收率均达到50%~200%。

结论：头孢氨苄胶囊的微生物限度检查方法具体如下：

取供试品10g，加入温度为38℃~40℃的100ml灭菌pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，摇匀后制成浓度为 1：10供试液；需氧菌计数：取1：10供试液2ml至50ml无菌 pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，摇匀后全量注入半封闭集菌器中过滤完全，用0.1%无菌蛋白胨水溶液300ml分3次冲洗滤膜，100ml/次，流速120ml/min，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA培养基（每200ml培养基含200万单位头孢菌素酶）平板上，30℃～35℃培养3~5天，培养之后进行需氧菌计数；霉菌及酵母菌计数：取1：10供试液1ml注入平皿，平行制备2个平皿，倾注SDA培养基混匀，20℃～25℃培养5~7天，培养之后进行霉菌及酵母菌计数。符合《中国药典》2020年版四部通则1105。

讨论：在进行本次微生物计数方法试验时，有以下几点值得关注的地方：

1. 头孢氨苄胶囊的胶囊壳在常温下不易溶于PH7.0缓冲液，使里面的主药成分无法及时溶解出来，须将缓冲液温度控制在38~40℃，快速溶解。

2. 需氧菌计数时，取1：10供试液2ml至50ml缓冲液中，取供试液2ml既增加了检验量，缩小限度范围成为<5cfu/g；至50ml缓冲液又使其降低首膜浓度，减少后续冲洗量和冲洗次数，打破传统检验直接取供试液1ml至滤膜上，降低胶囊类药品堵塞滤膜的风险。

3. 选取头孢菌素霉酶直接加入至TSA培养基中，而不是传统检验加入至冲洗液静置数分钟，达到节约时间成本，且常规购买头孢菌素酶规格为200万单位/瓶，一瓶酶至一瓶200mlTSA培养基，做到精准操作。

4. 查询抗菌谱，得知其对霉菌并无明显的抑菌性，所以只选择在TSA培养基中加入头孢菌素酶，SDA培养基不加酶。

参考文献

^「1」中华人民共和国药典2020年版四部（非无菌产品微生物限度检查1105）

[作者简介]第一作者 张正关（1987）男，云南玉溪 重庆科瑞制药（集团）有限公司 微生物检验员 主要从事药品微生物限度检查和车间环境监测

[作者简介]第二作者 陆建足（1990）女，重庆南岸 重庆科瑞制药（集团）有限公司 微生物检验员 主要从事药品微生物限度检查和无菌检查