气相色谱-质谱法与薄层扫描法测定六味地黄丸丹皮酚含量的差异对比

 气相色谱-质谱法与薄层扫描法测定六味地黄丸丹皮酚含量的差异对比

  ,曹丽锋 ,马玉珠

周口市公共检验检测中心（周口市食品药品检验所） 466000

【摘要】目的：对气相色谱-质谱法与薄层扫描法测定六味地黄丸丹皮酚含量的差异进行对比。方法：选取六味地黄丸（河南省宛西制药股份有限公司）作为样品，样品粉碎后待测,分别采用气相色谱-质谱法与薄层扫描法测定丹皮酚含量，对比两种方法鉴定中丹皮酚含量差异。结果：气相色谱-质谱法检测六味地黄丸中丹皮酚平均含量分别为0.173、0.144、0.204，薄层扫描法检测六味地黄丸中丹皮酚含量范围为0.172、0.140、0.205；两种方法检测加样回收率分别为104.0%、105.1%。结论：气相色谱-质谱法与薄层扫描法测定六味地黄丸丹皮酚含量差异不明显，结果准确，具有一致性。

【关键词】气相色谱-质谱法；薄层扫描法；六味地黄丸；丹皮酚；差异

六味地黄丸为《中国药典》收载品种，为我国传统医学中用于滋补肝肾之阴的代表药物[1]，方剂由熟地黄、山茱萸、丹皮、山药、茯苓和泽泻组成，现代药理试验发现药物同时具有保护肝脏、调节肾功能、抗衰老、降血压、抗肿瘤、免疫调节等药理作用[2]。丹皮为牡丹的甘草根皮，主要成分为丹皮酚，是六味地黄丸质量标准规定的重要监测指标，丹皮含量测定方法主要有直接蒸馏-UV法、薄层扫描法、高压液相色谱法等，而不同检测方法在丹皮酚含量鉴定中的差异则无相应研究。本研究采用气相色谱-质谱法、薄层扫描法对六味地黄丸中的丹皮酚进行测定，旨在探索六味地黄丸生产过程中的无损定量检测途径，具体如下。

1. 仪器与试药
   1. 仪器

薄层扫描法：仪器为KH-3000型全能型薄层色谱扫描仪（上海科哲生化科技有限公司），定量毛细管由日本岛津仪器有限公司生产，全自动薄层铺板器TD-II（北京同德创业科技有限公司），硅胶G（上海研生生化试剂有限公司），SKF-24超声波清洗器（上海隆拓仪器设备有限公司）。

气相色谱-质谱法与薄层扫描法：色质联用仪（上海精密仪器仪表有限公司），THD-M1智能超声波发生器（深圳市太和达科技有限公司），CR-8A色谱数据处理器（日本岛津仪器有限公司）。

1.2试药

六味地黄丸（河南省宛西制药股份有限公司；Z41021968；批号为020921、021101、021012），丹皮酚对照品以及内标正十六烷由中国药品生物制品检验所提供，其余试剂均为分析纯。

2. 方法

2.1薄层扫描法

   取六味地黄丸粉碎为直径<2mm的碎块，取50mg，取丹皮酚对照品50mg,置入50ml容量瓶内，采用无水乙醇溶解并稀释至刻度，对照品溶液浓度稀释浓度至1mg/ml，作为标准品溶液；取牡丹皮药材粉末2g左右，精密称定，按照样品溶液方法制备为10mg牡丹皮药材作为对照液，以精密仪器取丹皮酚对照品溶液1、2、3、4、5μl点样在同一硅胶板上，反射法锯齿扫描，波长λR=365nm，λs=274nm，扫描速度为20mm/min,狭缝1.25×1.25mm，线性校正：Sx=3，灵敏度为X2。层析方法：20×20cm硅胶G板，厚度为0.4mm，在105℃下活化30min，展开溶剂，环乙烷-氯仿-无水乙醇配比为（7:3:1），斑点观察，紫外灯下检识定位，获得峰面积积分值，外标法对丹皮酚含量进行测定。

2.2气相色谱-质谱法

   准确称取六味地黄丸粉碎剂及对照品适量，分别置入10ml量瓶中，无水乙醇溶解并定容，充分震荡后配为1mg/ml的储备液，取样品置入锥形瓶内，加入乙醇溶液，超声提取30min，移入50ml量瓶并定容，使用时充分摇匀，静置，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，即得，使用色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），梯度洗脱程度：0-10min时为33%B，19min时为60%B，19.01min至结束时为80%B，柱温25℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。测定完成后开展干扰性试验,取样品溶液、对品溶液以及阴性空白样品溶液在上述色谱条件下,观察丹皮酚对照品溶液与阴性空白样品溶液在相同保留时间内是否出现明显色谱,结果显示无明显色谱峰出现,表明被测组分离良好,无干扰.

2.3加样回收率试验

   精密量取对照品溶液1.0mg、2.0mg、3.0mg各3份，置入10ml量瓶内，精密加入1.0ml样品溶液，以内标溶液稀释至刻度，气相色谱分析或薄层扫描法，获取平均回收率。

3. 结果

3.1丹皮酚检出浓度

薄层扫描法:将丹皮酚与内标峰面积之比(As/Ai)作为响应值,以丹皮酚量(x)作为变量,得到回归方程:As/Ai=0.218×(μg)-0.308,相关系数为0.9995.气相色谱-质谱法:以对照品面积为纵坐标,以样品浓度为横坐标,进行线性回归,丹皮酚回归方程为y=145635x-107,相关系数为0.9991,不同方法丹皮酚检出含量见表1.

表1   薄层扫描法与气相色谱-质谱法检出丹皮酚含量

3.2回收率

气相色谱-质谱法、薄层扫描法加样回收率分别为104.0%、105.1%，RSD分别为1.51%、2.4%。

3. 讨论

中药的复方制剂由多种药材组成,成分比较复杂,而实现药物质量控制,主要通过对其中一种或多种主要活性成分含量进行测定.六味地黄丸源自《小儿药证直诀》,具有滋阴补肾功效,用于头晕耳鸣、肾阴亏虚、骨蒸潮热、腰膝酸软、消渴等症,在中成药中具有重要地位[3],因此六味地黄丸的质量控制尤为重要.

中国药典在2000版中以水蒸气蒸馏,274nm测定其吸收度的方法对丹皮酚含量进行测量,有学者[4]采用薄层扫描法对不同厂家六味地黄丸中成药中丹皮酚含量进行测定,以氯仿回流提取,点样在薄层硅胶GF254预制板上,根据环乙烷-乙酸乙酯(9.5:0.5)展开剂展开,之后测定波长λs=274mm、参比波长λR=400mm,以双波长反射法线性扫描测定,结果显示不同六味地黄丸中成药的回收率均在95%以上,分离效果理想.六味地黄丸因为内含蜂蜜,因此在溶解、提取时难度较大,提取容积的选择尤为重要,在对甲醇、无水乙醇、50%甲醇以及稀乙醇进行对比,并选择无水乙醇作为提取溶剂,薄层扫描法中,以反射法锯齿扫描，波长λr=365nm，λs=274nm，方法简单,重复性良好.气相色谱-质谱法在中药质量控制中运用时间较短,但是其优势已经被临床研究所证实[5-6],在六味地黄丸丹皮酚的测定中,对照品不易获得,单独采用气相色谱分析其成分定性难度较大,而以质谱法作为气相色谱法检测器,能够给出色谱峰丰富的碎片信息,从而更好的完成识别、定量[7-8],本次研究中气相色谱-质谱法检出丹皮酚平均含量分别为0.173、0.144、0.204,且干扰性试验显示抗干扰性良好.

但是本次研究中仅选用1个厂家的六味地黄丸作为样品研究,而实际情况下药材质量不同,丹皮酚含量相差不大,因此研究存在一定的片面性,需要在后续研究中进一步优化.

参考文献:

[1]崔荣兴,战丽彬.六味地黄丸在《周慎斋遗书》与《医家秘奥》中的运用探析[J].中医研究,2021,34(7):5.

[2]梁诗瑶,刘倩倩,黄胜,等.六味地黄丸药渣中4种活性成分含量测定及抗氧化活性研究[J].湖南中医药大学学报 2021,41(5): 707-713.

[3]王有鹏,刘璐佳,景伟超,等.基于数据挖掘的《小儿药证直诀》治疗儿科疾病用药配伍规律研究[J].现代中西医结合杂志,2020, 29(11):1189-1192.

[4]谢慧超,李凌军,王玉真,等.丹皮酚固体分散体制备表征及体外溶出特性研究[J].山东中医杂志, 2019,38(1):77-83.

[5]刘慧娟,胡叶青,马丽,等. 气相色谱-质谱联用法在中药及天然药物分析中的应用[J].宜春学院学报, 2020, 42(9):20-24.

[6]苏日古嘎,陈佳麟, 徐宁,等.色谱联用技术在中药及民族药物代谢组学研究中的应用进展[J]. 亚太传统医药 2021,17(6): 198-202.

[7]诸晨,钱勇.高效液相色谱-质谱联用法测定薏苡仁药材中黄曲霉毒素[J].食品安全质量检测学报,2019, 10(5):1273-1277.

[8]罗葵,宋学英.超高效液相色谱串联质谱法测定豆类食品中的游离神经递质类氨基酸[J].食品工业科技, 2021,42(18):317-325.