甲钴胺检验过程降解研究及预防措施

甲钴胺检验过程降解研究及预防措施

陶东伟，胡启萌

江苏海岸药业有限公司  江苏省苏州市215000

摘要：目的 避免甲钴胺在检测过程中发生降解。方法 经过对所有原因逐条分析确认, 确定影响甲钴胺有关物质测定项单杂结果偏高的主要原因，重新建立操作方法。结果 将无色透明的容量瓶更改为棕色容量瓶进行检测，暗室光照强度应控制在5 lx以下。结论 新确定的方法可行，能达到降低降解率的预期效果。

关键词：甲钴胺；有关物质；降解

Degradation research and preventive measures of methylcobalamin

in the inspection process

Tao Dongwei, Hu Qimeng

Jiangsu Coast Pharmaceutical Co., Ltd.  Suzhou City, Jiangsu Province  215000

Abstract: Objective To avoid the degradation of methylcobalamin during the detection process. Methods After analyzing and confirming all the reasons one by one, the main reasons affecting the high single-impurity result of the determination item of related substances in methylcobalamin were determined, and the operation method was re-established. Results The colorless and transparent volumetric flask was changed to a brown volumetric flask for testing, and the light intensity in the dark room should be controlled below 5 lx. Conclusion The newly determined method is feasible and can achieve the expected effect of reducing the degradation rate.

Key words: mecbalamin; related substances; degradation

甲钴胺（Mecobalamin）是维生素B12的活性形式，主要存在于动物的血液、髓液中，通过促进神经再生和拮抗谷氨酸诱导的神经毒性，发挥神经保护作用[1]，有效改善神经传导和神经性疼痛症状，广泛用于治疗周围神经病[2]。例如，糖尿病性神经障碍、多发性神经炎等周围神经病变，同时也可用于维生素B12缺乏引起的贫血。该药对周围神经具有良好的修复与营养能力，因此在市场上备受欢迎与关注。

由于甲钴胺性质不稳定, 对光极其敏感,因此，测定甲钴胺中的有关物质具有重要意义。甲钴胺及其制剂的有关物质测定方法包括高效液相色谱法（HPLC）、紫外分光光度法和酶联免疫法等[3-7]。其中，高效液相色谱法具有专属性好、灵敏度高的特点，并且可以同时测定主药和有关物质的含量。现采用HPLC法对甲钴胺有关物质检测方法的操作中的影响因素进行分析,采取相关措施并降低甲钴胺有关物质检测过程中的降解。

1 材料与方法

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：安捷伦Kromasil 100-5-C18 (4.6×250mm 5μm)，DAD紫外检测器，电子天平（梅特勒），照度仪（江苏海岸药业）

1.2药品与试剂

甲钴胺胶囊（厂家：江苏海岸药业有限公司，规格：0.5mg），甲钴胺对照品（厂家：中国食品药品鉴定研究院，批号：100692-202006，纯度：93.9%）乙腈（默克，HPLC级）、磷酸二氢钾、磷酸、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司，分析级）

1.3方法

1.3.1 色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.03mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（84:16）为流动相；检测波长为342 nm；柱温：30.0℃，运行时间：40min。

1.3.2 对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液的配制

所有溶液的配制均在暗室或红色的灯光背景中完成。

对照品溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

供试品溶液的配制：取本品适量，将内容物混合均匀，研细，精密称定约1450mg，至25ml量瓶中，加流动相10ml，超声10min，摇匀，使用有机滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

阴性溶液的配制：精密称取阴性对照样品1445mg，加流动相10ml，冰浴超声10min，滤过，使用有机滤膜过滤，取续滤液作为阴性对照溶液。

1.3.3测定方法

精密量取上述对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，单个杂质峰面积应不得大于对照溶液主峰面积的1倍（1.0%）；各杂质峰面积之和应不得大于对照溶液主峰面积的3倍（3.0%），所有溶液配制均避光操作。

1.4复测与重测

1.4.1复测

对两批供试品溶液1的原进样小瓶进行复测，结果如下：初测与复测典型杂质比较

结论：复测与初测时间相差4天，复测结果同初测结果相比，原容量瓶中主峰纯度明显降低， RT2.5min杂质及RT3.4min杂质明显变大，因甲钴胺溶液长时间放置在暗室红外下，存在进一步降解，原进样瓶瓶溶液放置在暗室液相色谱仪进样盘上，仪器有黑色挡板，故避光效果好，且内部避光比较均一，RT2.5min杂质未增大，反而变小，RT3.4min杂质变大，可能为甲钴胺光降解成RT2.5min杂质后可能再次降解生成RT3.4min杂质。原容量瓶溶液放置在液相室，有暗室红光照射，比放置在仪器内部见光程度大，故降解程度大，且各个容量瓶位置不一样，见光程度存在差异，降解程度不同，RT5.0min变化趋势慢，在仪器内部避光效果好的情况下，未出现变大趋势，在红光下仍存在增大趋势，RT2.5min杂质仍持续在增加，说明实验室目前红光（照度：15lx）下使用无色透明容量瓶不符合避光要求，在仪器内部条件下（照度：0 lx），避光效果好。上述初测与复测典型杂质比较是以面积百分比的计算方式进行。

1.4.2重测

重测典型杂质结果汇总如下：

棕色容量瓶，暗室光照调到最低（照度：5 lx）

结论：重测所用器具为棕色的容量瓶和棕色的进样小瓶，流动相及稀释液为重新配制，所用试剂仅乙腈为不同瓶，其余试剂未发生变化，色谱柱及仪器同初测一致，重测单杂结果均正常，单杂为RT13.4min杂质，且杂质RT3.4min峰未检出。RT2.2min（扣减辅料峰）与RT4.7min杂质均未超过0.2%，表明使用棕色的容量瓶和棕色的进样小瓶操作时，在照度为5 lx的情况下，未发生降解现象。

1.5.假设性实验

1.5.1假设性试验（一）

目的：

（1）在使用透明容量瓶的条件下，考察称量时间对甲钴胺胶囊光解的程度的影响。

（2）在使用透明容量瓶的条件下，考察透明进样小瓶和棕色进样小瓶对甲钴胺胶囊降解的程度的影响

（3）在使用透明容量瓶的条件下，考察供试品溶液在红光灯照射下对甲钴胺胶囊光解的程度的影响。

假设性试验方案

选取同一批次样品进行试验，使用干燥的透明容量瓶

a)控制称量操作时间为7min，15min，20min，每个时间点称取1份样品

b)取其中一份分别用透明进样小瓶和棕色进样小瓶进行进样分析

c)扩大1倍称样量，称取1份样品，2900mg至50ml量瓶中，加流动相20ml溶解超声后，放置在红光灯下1h，2h，3h，4h。

1)称量时间结果

从以上结果表明，称量时间对检测结果无影响。

2)透明进样小瓶和棕色进样小瓶（称量时间7min下供试品）结果

以上结果表明：称量时，使用无色透明容量瓶和棕色容量瓶，短时间称量，对检测结果无影响。

3)供试品溶液红灯光照时间结果

红光光照时间越长，甲钴胺胶囊光解程度越高，纯度变小，RT2.5min杂质随光照时间增加而变大，RT3.4min杂质4小时内有增大趋势，但很缓慢，结合前述调查判断RT3.4min杂质可能需要同时具备光降解与其他条件；RT4.9min杂质与0时相比变大，1小时后未有明显变大趋势。

1.5.2假设性试验（二）

假设性检验目的

（1）定位出供试品溶液中甲钴胺降解物羟钴胺与氰钴胺。

（2）在使用透明容量瓶的条件下，考察开门时间对甲钴胺胶囊降解的程度的影响。

试验方案：取有关物质已检测合格的样品进行试验，使用干燥的容量瓶。

（1）通过向甲钴胺对照品溶液和供试品溶液中加入羟钴胺与氰钴胺定对照品位出供试品溶液中甲钴胺降解物羟钴胺与氰钴胺。

（2）将供试品溶液放置在检验工作台上，分别开门1min，3min，5min，比较杂质大小。

1)峰定位结果

羟钴胺与辅料峰重叠，未达到分离要求。历史批次结果计算时，RT2.5min杂质均判定为辅料峰，峰面积全部扣除，未参与计算，故需要评估历史批次RT2.5min杂质对检测结果的影响。

2)开门时间对供试品溶液的影响结果

结果表明：开门时，有白光进入暗室，随着时间的增加RT2.5min杂质变大，RT3.5min杂质较小，且未有变化。RT5.2min杂质变大，表明白光照射下对供试品溶液影响较大。

2.结果

复测与重测结果表明：光照强度与光照时间对甲钴胺降解程度有影响，光照强度越强或光照时间增加，均可加速甲钴胺胶囊的降解的速度。使用棕色的容量瓶和棕色的进样小瓶操作时，在照度为5 lx的情况下，未发生降解现象。

假设性实验一结果表明：（1）在使用透明容量瓶的条件下，称量时间对检测结果无影响。（2）在短时间内称量时，使用无色透明容量瓶和棕色容量瓶，对检测结果无影响。（3）红光光照时间越长，甲钴胺胶囊光解程度越高

假设性实验二结果表明：开门时间较长对甲钴胺胶囊降解程度有影响。因此，在甲钴胺检测过程中，不可用无色透明的容量瓶和进样小瓶进行甲钴胺胶囊的相关检测，且暗室光照强度应控制在5 lx以下。

3.讨论

无色透明的容量瓶避光效果较低，导致溶液见光发生降解，降解杂质有RT2.5min、RT3.4min、RT5.0min。

甲钴胺见光降解产生羟钴胺，查阅羟钴胺产品的治疗作用，大剂量应用，可作为氰化物的解毒剂使氰化物转化为氰钴胺，羟钴胺在有氰离子条件下产生氰钴胺。查询实验室所用的试剂，重测和假设性试验所用的试剂，仅乙腈不同瓶，在更换不同瓶的乙腈后，所得结果未产生0.05%以上的氰钴胺峰，查询相关学术信息，乙腈在精制过程中会存在微量HCN，供试品溶液中羟钴胺与微量HCN生成氰钴胺，但避光操作时未降解产生羟钴胺，氰钴胺便不会生成，故严格避光条件下可以防止降解发生。

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