基于1H NMR代谢组学对丁毒豆治疗蟹足肿的机制研究

基于1H NMR代谢组学对丁毒豆治疗蟹足肿的机制研究

王佳婧

白城医学高等专科学校吉林白城  137000

摘要：蟹足肿是人特有的常见皮肤疾病，又名瘢痕疙瘩，痛痒强烈，侵袭率高，术后极易复发，严重影响工作和生活。为更好指导我省民间药丁毒豆在临床治疗蟹足肿的应用，本研究基于1H NMR代谢组学对丁毒豆抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖机制进行研究。首先应用MTT法检测丁毒豆对成纤维细胞存活率，进而应用1H NMR技术分析正常和丁毒豆作用的瘢痕疙瘩成纤维细胞差异代谢物，通过MetaboAnlyst平台筛选出主要代谢途径，最终在细胞水平上探讨丁毒豆治疗蟹足肿的整体作用机制。该研究不仅探索了民间药丁毒豆治疗蟹足肿机制研究新方法，而且为其在临床的合理应用提供科学依据。

关键词：代谢组学核磁共振丁毒豆蟹足肿

蟹足肿是人特有的常见皮肤疾病，又名瘢痕疙瘩（keloid），痛痒强烈，侵袭率高，术后极易复发，多年不易痊愈，又称为瘢痕瘤。目前，瘢痕疙瘩发病率高，男女比例为1:2，患病人群主要集中在15-45岁，并呈逐年上升趋势。因此，寻找科学有效的蟹足肿防治方法具有十分重要的临床意义。蟹足肿的病理机制目前尚不清楚，其病理特征是一种以皮肤真皮层I、Ⅲ型胶原过度增生为主的皮肤病，主要表现为大量致密、螺旋状排列的透明变性的胶原纤维束和分裂象较多的纤维母细胞。蟹足肿的临床表现在一定程度上与肿瘤有很多相似之处：都以较多的胶原沉积为特征，可进行性地浸润到未受损伤的真皮，与正常皮肤无明确的分界线，呈浸润性生长，生长持续时间相当长，并有相当高的复发率，均颇类似于肿瘤。但蟹足肿不具备肿瘤的转移特性，并不具备肿瘤的异型性。国内外研究表明许多肿瘤相关基因及细胞因子在蟹足肿的发生发展中起着重要作用，一些治疗肿瘤的方法和药物对蟹足肿的疗效显著，这更加说明蟹足肿是具有一定肿瘤特性的病变。提示蟹足肿的研究和治疗中借鉴肿瘤的研究成果具有重要意义。

丁毒豆是我省民间药，又名独角莲，在民间用于治疗蟹足肿。为天南星科（Araceae）犁头尖属（Typhonium Schott）植物，是中国特有植物，长白山地区是其主要产地。中医认为丁毒豆具有燥湿化痰、祛风止痉、解毒散结作用。我们在前期实验研究中已证实独角莲根茎水提取物可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，并诱导其凋亡，但具体代谢调节机制尚不清楚。细胞代谢组学研究能够直接描述特定细胞类型的代谢，快速直观，干扰小，是微观生命体的宏观表现。并且未见有应用1H NMR技术分析丁毒豆治疗蟹足肿的细胞代谢组学研究报道。为更好指导丁毒豆在临床治疗蟹足肿的应用，本研究基于1H NMR代谢组学对民间药丁毒豆治疗蟹足肿的整体机制进行研究[1]。通过应用1H NMR技术对正常和丁毒豆作用成纤维细胞中的内源性代谢物变化进行考察，筛选鉴定各组细胞差异代谢物和分析主要代谢途径，从整体的角度系统全面的在细胞水平上探讨丁毒豆治疗蟹足肿的作用机制。

1、样品制备

采用水提醇沉法和膜分离技术[2]，将丁毒豆中用水煎煮后，根据化合物在分子水平的溶解度大小和分子量大小不同，得到不同的分离组分，从而分离得到丁毒豆水煎液组分及各分离组分。丁毒豆用料液比为1:10（g/mL）的水浸泡30min，加热回流1h，收集水煎液；然后向残渣中加入等量的水，再次回流1h。将两份水煎液合并、过滤、80℃水浴蒸干、4℃保存备用，作为丁毒豆水煎液组分。用20倍量水将丁毒豆水煎液组分干膏复溶，使用1KDaUltracel®PLC再生纤维素复合膜的超滤系统过滤丁毒豆水煎液组分，然后4倍量的纯净水冲洗，得到膜分离组分A（MW＜1KDa）和膜分离组分B（MW＞1KDa）两个组分，80℃水浴蒸发，4℃保存备用，作为丁毒豆膜分离组分A和丁毒豆膜分离组分B。用10倍量水将丁毒豆水煎液组分干膏复溶，加入4倍量的无水乙醇在4℃下沉淀48h后，过滤，得到沉淀物组分C（沉淀物组分）和上清液组分D（上清液组分）两个组分，80℃水浴蒸干，4℃保存备用，作为丁毒豆沉淀组分C和丁毒豆上清组分D。

丁毒豆共计402g，两次水煎煮并蒸干后获得丁毒豆水煎液组分干膏63.57g，出膏率为15.81%；取20g丁毒豆水煎液组分干膏，稀释后经1KDa超滤膜浓缩，获得丁毒豆膜分离组分A（MW＜1KDa）9.84g和丁毒豆膜分离组分B（MW＞1KDa）8.62g，出膏率分别为7.78%和6.81%；同时，取20g丁毒豆水煎液干膏，经过传统的水提醇沉技术处理后获得丁毒豆沉淀组分C7.7g和丁毒豆上清组分D11.63g，出膏率分别为6.09%和9.19%。

本研究基于化学成分在分子水平上分子量和溶解度的差异，采用现代膜分离技术和传统水提醇沉法对丁毒豆复方中的化学成分进行了分离提取，共分离提取到丁毒豆水煎液组分63.57g、丁毒豆膜分离组分A（MW＜3KDa）9.84g、丁毒豆膜分离组分B（MW＞3KDa）8.62g、丁毒豆沉淀组分C7.7g和丁毒豆上清液组分D11.63g，为后续实验奠定物质基础。

2、丁毒豆抑制蟹足肿活性组分的筛选

以瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）构建蟹足肿模型，考察KFB细胞存活率情况，筛选丁毒豆抗蟹足肿的活性组分，为进一步研究其物质基础和作用机制奠定基础。与正常组比较，丁毒豆膜分离组分B和沉淀组分C在浓度为15.125-250μg/mL区间细胞存活率明显低于正常组，其中膜分离组分B组在125μg/mL浓度下的细胞抑制最强（p＜0.01）。表明丁毒豆膜分离组分B在125μg/mL浓度下对KFB细胞抑制作用最强，为丁毒豆抗KFB细胞的活性组分（图1）。丁毒豆水煎液组分、膜分离组分A和沉淀组分D对TM3细胞抑制作用没有明显影响。因此，将丁毒豆膜分离组分B确定为抗蟹足肿的活性组分，针对其进行更深入的研究，为后期进一步发掘丁毒豆中潜在的抗蟹足肿的活性成分和分子机制打下基础。

图1 丁毒豆水煎液及不同组分对KFB细胞存活率的影响

3、基于代谢组学筛选丁毒豆抗KFB细胞的差异代谢物

接种处于对数生长阶段的KFB细胞于培养瓶中，接种量为1×107，分别设置对照组和丁毒豆活性组分组，在37℃、5%CO2下培养24h。当细胞附壁并处于良好生长状态时，用无血清培养基处理细胞12h，丁毒豆活性组分组中加入终浓度为125μg/mL的样品，对照组用DMEM培养基补齐，每组设6个平行瓶，培养24h后收集各瓶中的细胞，洗涤和离心两次，弃上清液，用液氮迅速淬灭细胞，并在-80℃下储存过夜。

取出细胞，加入甲醇和水（1:2，v/v）溶液混合并涡旋后，在冰浴上超声破碎处理（超声处理设置为运行5秒，暂停9秒，运行20分钟）使细胞内容物完全溶解。将细胞破碎液在4℃、13000rpm/min离心10分钟，取上清，冻干并用于1HNMR代谢组学研究。

将细胞冻干粉溶解在600μL磷酸盐缓冲液（含有0.005%TSP，10%重水，0.1mol/LPBS，pH值7.4）中，在4℃、13000rpm/min离心10min，上清液吸取到5mmNMR管中。所有样品均在25℃下用BrukerAvanceIII600光谱仪（频率600MHz）进行分析。以TSP为内标，应用NOSEY序列，松弛延迟320ms，谱宽12019.12Hz，扫描64次。

使用MestReNova软件处理原始NMR文件。经过相位校正、基线校准、定位和归一化后[3]，以δ0.04为时间间隔对δ0-9核磁共振谱进行积分，并将积分数据导入Excel中进行汇总，δ4.80-5.06（残水峰）不进行积分[4-6]。

处理的2组数据导入SIMCA-P14.0软件进行多元统计分析[7]，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），并验证数据模型有效性[8]，求得变量权重值（Variable weight value，VIP）和倍增值（Fold change，FC）[9]。

通过化学位移、峰型和耦合常数等分析，并参考文献鉴定了KFB细胞中包括氨基酸、有机酸和脂类在内的41种代谢产物，为丁毒豆活性组分对KFB细胞的1H NMR代谢产物。

4、KFB细胞差异代谢物分析

为阐明KFB细胞经丁毒豆活性组分处理前后的代谢产物差异，通过多元统计分析方法进一步分析处理数据。利用无监督主成分分析（PCA）发现，丁毒豆活性组分组与正常组有明显的分离趋势，有监督的PLS-DA排列实验（Permutation test）结果（R2X=0.859，R2Y=0.984，Q2Y=0.983）表明，该模型有效且稳定，预测性能高，丁毒豆活性组分组与正常组差异有统计学意义，可能是由于丁毒豆活性组分组的细胞代谢发生了明显变化。采用有监督的OPLS-DA方法清除与样本分类不相关的因素，最大限度地提高组间的分离度（图2）。并根据可变重量值（VIP）和t检验结果，选取33种差异代谢物（VIP>1，p<0.05），用倍增变化（FC）表示其变化趋势。

图2 丁毒豆活性组分组与正常组1H NMR代谢组学OPLS图

5、潜在代谢生物标志物及代谢通路分析

正常组和丁毒豆活性组分组进行建模比对，VIP>1及t检验p＜0.05的35种差异代谢物.为了探索丁毒豆活性组分组抗蟹足肿KFB细胞后可能涉及到的代谢通路，将上述35个差异代谢物带入MetaboAnlyst4.0（https://www.metaboanalyst.ca/）在线分析平台，选择Homo sapiens（human）路径库作为代谢通路数据库，Hypergeometric Test作为通路富集分析，Relative-betweeness Centrality分析通路拓扑结构，筛选出影响值大于0.1的代谢通路，确定35种潜在生物标志物分别分布于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图3a），甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（图3b），谷胱甘肽代谢（图3c），丙酮酸代谢（图3d），泛酸和辅酶A生物合成（图3e），氨酰tRNA的生物合成（图3f），赖氨酸降解（图3g），磷酸肌醇新陈代谢（图3h），谷氨酰胺和谷氨酸代谢（图3i）和甘油磷脂新陈代谢（图3j）10条代谢通路中，表明丁毒豆活性组分组显著影响了KFB细胞氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢等代谢通路中的相关节点，发挥抑制蟹足肿作用。

图3 丁毒豆活性组分组和正常组的代谢组学视图

注：a:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；b:甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；c:谷胱甘肽代谢；d:丙酮酸代谢；e:泛酸和辅酶a生物合成；f:氨酰基-tRNA生物合成；g:赖氨酸降解；h:磷酸肌醇代谢；i :D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；j:甘油磷脂代谢

参考文献

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基金项目：吉林省中医药管理局科技项目资助研究（2020195）