双支装卷筒状吸管微生物限度计数方法适用性试验研究

双支装卷筒状吸管微生物限度计数方法适用性试验研究

王玉兰，莫静燕，张海琴，吴萍

扬子江药业集团江苏紫龙药业有限公司 质检中心，常州213000

摘要 目的：建立双支装卷筒状吸管微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2020年版四部“通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 ”的要求进行验证。结果：验证中所有试验菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均在50%~200%范围内，采用常规法即可检出大肠埃希菌。结论：该方法有效可行，可用于指导双支装卷筒状吸管微生物限度的日常检测。

关键词：双支装卷筒状吸管；微生物限度检查法；菌种。

The Study of Microbial Limit Suitability Testfor  Double-barrelled and tubed pipet

WANG Yu-lan,MO Jing-yan,ZHANG hai-qin, WU Ping

Quality Inspection, Jiangsu Zilong Pharmaceutical Co., Ltd of Yangtze River Pharmaceutical Group, Jiangsu Changzhou 213000

ABSTRACT  Objective: To establish the microbial limit test method of Double-barrelled

and tubed pipet. Methods: A validation on the microbial limit test was conducted in accordance with the microbial enumeration tests and test for specified microorganisms stated in the general rule 1105 and 1106 of Part IV of Chinese Pharmacopoeia (2020 edition). Results: The recoveries of all the test strains (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans and Aspergillus niger) in the validation were within the range of 50%-200%, Escherichia coli could be investigated by conventional method. Conclusion: The method is effective and feasible, and can be used for the microbial limit test of Double-barrelled and tubed pipet.

KEY WORDS  Double-barrelled and tubed pipet; Microbial Limit Test; Strain.

建立药品微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该样品的需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定和控制菌检查[1]。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法和检查方法应重新验证。含抑菌成分的药品的微生物限度检查，必须消除供试液抑菌活性后，再根据药典规定的方法进行检查[1,2]。同时，所采用检测方法需进行验证试验，以确认供试品的抑菌活性和保证测定方法的可靠性。双支装卷筒状吸管用于口服液药品的吸食。目前文献报道中尚无双支装卷筒状吸管的微生物限度检查方法。因此本文对双支装卷筒状吸管微生物限度检查法进行了适用性试验，以确定其微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

大肠埃希菌[Escherichia coli，CMCC(B) 44102]、金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC(B) 26003]、铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC(B) 10104]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，CMCC(B) 63501]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC(F) 98001]、黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC(F) 98003]均购于北京三药科技开发公司。

1.1.2 试液

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（江苏益玛生物科技有限公司，批号：211029-6）

1.1.3 培养基

胰酪胨大豆琼脂培养基（批号：211207-7）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：211013-12）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：211013-11）、麦康凯液体培养基（批号：211213-8）均购于江苏益玛生物科技有限公司；麦康凯对照琼脂培养基（批号：135009-201905）购于中国食品药品检定研究院。

1.1.4 供试品

双支装卷筒状吸管批号为426417-2108001，由扬子江药业集团江苏紫龙药业有限公司提供。

2 方法

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验[3]

2.1.1 供试液制备

称取供试品10g,用无菌剪刀剪断，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,充分振摇使混匀,作为1:10的供试液。取1:10的供试液10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,振摇使混匀,作为1:100的供试液。

2.1.2 菌液制备

使用前将未开启的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌株平衡至室温。使用时，用已灭菌的剪刀打开菌株瓶盖和瓶塞，用移液枪吸取1.1ml复溶液加入菌珠西林瓶中，盖上瓶盖，静置约5~10s，涡旋震荡5~10s，或使用其它方法使其完全溶解。

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉10倍递增稀释，制成每1ml含菌数不大于10000cfu的菌悬液。

将大肠埃希菌菌液以10倍递增稀释，制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。

上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

2.1.3 试验组

2.1.3.1 需氧菌总数(平皿法)

需氧菌总数：分别吸取1:10、1:100供试液各9.9ml和不大于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液0.1ml混匀后，各取1ml注入平皿中，加入冷却至约45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，置操作台上待凝。结束后置于30~35℃倒置培养不超过3天，含有白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液的平皿于30~35℃倒置培养不超过5天，点计菌落数，平行制备2个平皿。

2.1.3.2霉菌和酵母菌总数(平皿法)

霉菌和酵母菌总数：分别吸取1:10、1:100供试液各9.9ml和每1ml含菌数不大于10000cfu的白色念珠菌菌悬液及每1ml含孢子数不大于10000cfu的黑曲霉孢子悬液各0.1ml混匀，吸取1ml注入平皿中，加入冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml。混匀，凝固，于20~25℃倒置培养不超过5天，点计菌落数，平行制备2个平皿。

2.1.4 菌液对照组

2.1.4.1 需氧菌总数(平皿法)

需氧菌总数：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml和每1ml不大于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液0.1ml混匀后，取1ml注入平皿中，加入冷却至约45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml，于30~35℃倒置培养不超过3天，含有白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液的平皿于30~35℃倒置培养不超过5天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.4.2 霉菌和酵母菌总数(平皿法)

霉菌和酵母菌总数：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml和每1ml含菌数不大于10000cfu的白色念珠菌菌悬液及每1ml含孢子数不大于10000cfu的黑曲霉孢子悬液各0.1ml混匀，吸取1ml注入平皿中，加入冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml。混匀，凝固，于20~25℃倒置培养不超过5天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.5 供试品对照组

2.1.5.1 需氧菌总数(平皿法)

需氧菌总数：分别吸取1:10、1:100的供试液各1ml注入平皿中，加入冷却至约45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml。于30~35℃倒置培养不超过5天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.5.2 霉菌和酵母菌总数(平皿法)

霉菌和酵母菌总数：分别吸取1:10、1:100的供试液各1ml注入平皿中，加入冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml。混匀，凝固，于20~25℃倒置培养不超过7天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.6阴性对照组

2.1.6.1需氧菌总数(平皿法)

需氧菌总数阴性对照：吸取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液1ml注入平皿中，加入冷却至45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml。混匀，凝固，于30~35℃倒置培养不超过5天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.6.2 霉菌和酵母菌总数(平皿法)

霉菌和酵母菌总数阴性对照：吸取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液1ml注入平皿中，加入冷却至45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml。混匀，凝固，于20~25℃倒置培养不超过7天，点计菌落数。平行制备2个平皿。

2.1.7回收率计算与可接受标准

2.1.7.1 回收率计算

按下式计算试验组各菌种的平均菌数与供试品对照组的平均菌数之差：C=CMO-CM1；

式中：CMO：试验组的平均菌数；CM1：供试品对照组的平均菌数。

按下式计算各菌种的回收率(Recovery)：回收率R=

式中：C：供试品中回收的所加入规定数量的菌数；M：菌液组的平均菌数

2.1.7.2可接受标准

在以上3次独立的平行试验中，试验组的菌种回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应在0.5~2范围内，则该检测方法成立。若3次中任一次任一菌种的回收率超出0.5~2范围，则重新进行检测方法的验证。在以上3次独立的平行试验中，阴性对照组平均菌落数应为0 cfu/皿。

2.1.8 试验结果

结果见表1、表2。经过3次验证，上述试验菌的试验组回收率均在0.5-2之间，符合要求，故可以采用上述方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查

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表1 需氧菌、霉菌和酵母菌总数验证结果（稀释级别：1:10）（n=3）

表2  需氧菌、霉菌和酵母菌总数验证结果（稀释级别：1:100）（n=3）

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2.2 控制菌的检查方法验证[4]

2.2.1 大肠埃希菌检查

2.2.1.1供试品组

取1:10的供试液10ml（相当于供试品1g），置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于30℃~35℃培养18~24小时。取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体中，置42~44℃培养箱中培养24~48小时后，划线接种于麦康凯琼脂培养基上，置30℃~35℃培养箱中培养18~72小时。

2.2.1.2 阳性对照组

取1:10的供试液10ml（相当于供试品1g），置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，再加入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，于30℃~35℃培养18~24小时。取上述培养物1 ml，接种至100ml麦康凯液体中，置42~44℃培养箱中培养24~48小时后，划线接种于麦康凯琼脂培养基上，置30~35℃培养箱中培养18~72小时。

2.2.1.3 阴性对照组

取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，培养条件及检查方法同供试品组。

2.2.1.4 结果判断

阳性对照组应检出试验菌，并且对麦康凯琼脂培养基上的菌落进行分离、纯化及适宜的鉴定，确认为大肠埃希菌；供试品组和阴性对照组应不得检出大肠埃希菌，则该试验方法成立。

2.2.1.5 试验结果

从表3可以看出，阳性对照组呈阳性。菌落为鲜桃红色的典型菌落，且对平板上的单菌落进行分离纯化及革兰氏染色镜检，确证为大肠埃希菌。供试品组和阴性对照组均为阴性，故可以照此供试液制备法和控制菌检查法进行双支装卷筒状吸管的大肠埃希菌检查。

表3 大肠埃希菌控制菌方法验证结果（n=3）

3. 讨论

微生物限度检查方法验证工作是一个极繁琐、复杂、耗时耗材的操作过程，周期长，干扰因素多

[5,6]，控制不当很难达到验证要求和效果。这就要求验证单位必须具备严格的操作环境，实验工作者应具有一定的理论基础和工作经验，严格按操作规范进行操作，减少和避免方法验证结果的误差。

双支卷筒状吸管用于吸食口服液药品等。建立其微生物限度检查方法并对其进行验证有着极其重要的意义。上述试验表明：试验对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉生长无影响，其试验组回收率均在0.5-2范围内，控制菌供试品对照组阳性菌生长良好，符合2020年版《中国药典》微生物限度检查适用性试验要求。

参考文献

[1] U.S. Pharmacopeia National Formulary. Microbiological examination of nonsterile products: microbial enumeration tests[Z]. United States: United Book Press, USP40-NF35: 117.

[2] U.S. Pharmacopeia National Formulary. Microbiological examination of nonsterile products: test for specified microorganisms[Z]. United States: United Book Press, USP40-NF35: 123.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].北京：中国医药科技出版社, 2020:1105.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].北京：中国医药科技出版社, 2020:1106.

[5] Zhang ZZ. Error influencing factors of drug microbial limit test[J]. Chinese Community Doctors, 2016-29.

[6] Yang J. Analysis of factors influencing the results of the microbial limit test of drugs[J]. Chinese Pharmaceutical Affairs, 2008-12.

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