RNA干扰HOX基因的表达与白血病基因治疗的研究进展

RNA干扰HOX基因的表达与白血病基因治疗的研究进展

黄慧平

成都市双流区第一人民医院（四川大学华西空港医院）, 四川成都 610200

摘要  研究表明HOX基因与白血病的发生发展有着密切联系。HOX基因与早期造血干细胞的功能有关，又参与了后期造血细胞的分化与系定向分化过程，其表达异常可导致白血病的发生。RNA干扰技术是双链RNA（double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异性转录后引起同源靶基因表达沉默，从而阻断靶基因的表达，是一种高效的基因阻断技术。利用RNAi技术,抑制HOX基因的表达,可能成为白血病基因治疗的新途径，本文对RNA干扰HOX基因用于白血病基因治疗的研究作一综述。

关键词 HOX基因  RNA干扰  白血病基因治疗

1 HOX基因的概述

1.1 HOX基因的结构特点

    同源异型盒基因（homeobox genes HOX)是在酵母乃至人类几乎所有真核细胞中表达的一类基因，最初由Mcginnis等[1]在果蝇发育调控的研究中发现。HOX被分为两大类，人类HOX基因家族属于HOX I类基因，迄今已鉴定出了39个人类HOX基因，成簇的出现，包含A、B、C、D 4个簇，依次定位于7、17、12、2号染色体上，每簇均含有9～11独立的，具有特定的时空表达模式基因；HOX基因不论片段大小，均含有183bp的高度保守序列，它编码61个氨基酸，称为同源结构域(Homeodomain，HD)。HOXⅡ类又称为non-HOX基因，根据附加的保守序列又可分以为若干个家族，包括Pax、Emx、Msx、Pou、Tale等。

1.2 HOX基因表达特点：

胚胎发育时期，HOX在基因簇中的表达是按照染色体中3’→5’端，以时间先后顺序逐个启动的，在特定空间位置依次表达或沉默。在同一表达区，同一染色体上越靠近5’端的基因比其前部的基因在表达上更有功能上的优势。HOX基因可以部分或完全代替被影响的异簇同序号的HOX基因的功能。等位基因突变越多，表现型变异就越严重[2]。每个HOX基因在胚胎发育过程中都有各自的范围，一定区域内的HOX基因的表达与其特定的体节形成有关[3]。

研究结果显示，HOX基因可有如下特点：参与肿瘤的发生、发展，尤其是调控肿瘤的增殖、分化以及转移等；诱导上皮细胞表面标志物以及整合素的表达水平改变，重建肿瘤细胞的周围细胞以及细胞外基质的联系，促进或者抑制上皮间质的转化；与生长因子以及血管生成因子相互作用，从而调控肿瘤新生血管的生成；参与了ｐ5３信号通路、Ｒａｓ- ＭＡＰＫ 信号通路等经典信号通路的调控；受到表观遗传学的调控[4]。

2 HOX基因与白血病

白血病是血液系统的恶性增殖性疾病，常表现为出血、贫血、感染以及浸润等临床症状，在儿童恶性疾病的发病率高居首位[5，6]。同源盒基因 (homeobox gene,Hox)编码一类转录因子，参与造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC）增殖、分化、成熟，HOX基因是同源盒基因大家族中的一员，是一类控制胚胎和细胞分化的调节基因，HOX基因与白血病的发生发展有着密切的联系[7-9]。HOX基因的异常表达可使细胞分化成熟障碍 ，造血能力降低 ，甚至可以导致白血病的发生和发展。HOX基因的异常表达能够通过改变肿瘤的不同激素受体及因子受体等受体信号转导途径，促进肿瘤的发生发展、增强肿瘤的转移能力和侵袭能力。

HOX基因的紊乱与白血病的发病相关，尤其是HOXA和HOXB族基因，与急性髓性白血病关系密切。HOX基因在造血过程中调控作用表现为多样性和重复性，如单个红系造血系统由HOXB2、HOXB4、HOXC6、HOXA5等多个HOX亚基因簇一起作用。已有研究表明，在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML)患者体内，HOX基因广泛表达于白血病细胞，AML的发生与多种HOX基因以及转录因子的表达密切相关。HOXA簇基因是HSPCs的主控基因，不仅影响造血干细胞数量，还参与调控淋巴系的正常分化，也是导致白血病发病的原因。HoxA簇基因作为同源异型基因家族中的一员，主要调控淋巴系的正常分化. Bach 等对多种 HOXA 基因进行全面的评价，发现在早期的造血细胞中HOXA1、 HOXA7、 HOXA9 和HOXA10等，均体现出显著的致癌潜能。HOXA10基因异常高表达与儿童急性白血病的发病有密切关系， 其在AML中显著高表达,可以作为区分淋系和髓系白血病的标志性基因。在人类AML中HOXA10基因编码的转录因子过表达，过表达的HOXA10可通过与细胞增殖、凋亡、周期有关的靶基因来抑制髓系细胞的凋亡,且能阻碍IFN-γ途径介导的凋亡。Liu等，研究表明，HOXB6基因在人类造血干/祖细胞（HSPC）向粒-单系和红系祖细胞增殖分化过程中的不同阶段稳定持续表达，证实HOXB6是人类造血干/祖细胞（HSPC）向粒单-系和红系祖细胞的正常增殖分化过程中的调控基因之一。HOXB4基因的mRNA表达水平与多药耐药基因ABCBI基因呈负相关，表明HOXB4阳性患者对化疗药物的敏感性增加。

3 RNA干扰技术概述

  RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术发现于20世纪90年代，是通过内源性或外源性双链RNA（double strand RNA,dsRNA)阻断或者降低同源基因表达，产生相应的功能型缺失的现象，是转录后调控的一种重要途径，属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptgene silencing，PTGS)[20]。RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可特异性地沉默特定基因，使该基因功能丧失或降低突变，在白血病的治疗上呈现出巨大的应用前景。运用RNA干扰技术沉默HOXA基因的表达，成为目前治疗白血病新的研究方向。这种现象几乎存在于所有的真核组织中。即细胞中导入与内源性 mRNA 编码区某段序列同源的dsRNA，胞质中的核酸内切酶（Dicer)将该dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21~23bp),即RNA干扰相关效应分子（siRNA),介导其互补同源的mRNA特异性降解，从而阻断靶基因表达。新产生的siRNA片段再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮同源mRNA的降解，产生了级联放大效应，显著增强siRNA对基因表达的抑制作用。

真核生物中存在两种主要非编码RNA(nocodingRNA，ncRNA)小分子，即小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)分子。miRNA调控机制的研究结果还显示，以miRNA做底物的RISC对基因的调控活性是小干扰RNA的10倍。且它可以影响基因的表达而不需改变基因序列，因而miRNA在疾病的诊断和治疗领域也具有巨大的利用价值。siRNA的来源是外源性长dsRNA，siRNA是双链结构，siRNA能精确识别位于外显子区域的互补靶序列，通过其反义链和靶mRNA共同组成RNA诱导RISC（RNA-induced silencing complex,RISC)，导致靶序列的降解而诱导RNAi与普通的siRNA相比,具有短发卡结构的双链ＲＮＡ能够产生更强的RNAi效应miRNA是内源性单链茎环状pre—miRNA，miRNA是单链结构，而miRNA作用的靶位点主要是3’的基因非编码区，通过与靶mRNA不完全碱基互补配对抑制mRNA的翻译 

4 RNA干扰与白血病基因治疗

RNA干扰技术具有特异性、高效性、稳定性、可遗传性等特点，较之技术难度高、费用高、试验周期长的探针杂交、基因敲除等传统方法，RNA干扰技术的操作更简单，效果更明显。应用RNA干扰技术，抑制某些特定基因的表达，可能成为治疗白血病的新途径，Wilda等在白血病和淋巴瘤的研究过程中，利用RNA干扰技术，使慢性髓性白血病和急性淋巴母细胞瘤瘤细胞的生长分化成功地受到阻止。Zhu等利用慢病毒载体shRNA沉默BaF3细胞系基因，可明显抑制其相应的mRNA及蛋白质表达，并增强BaF3细胞对伊马替尼的敏感性。

HOX基因在白血病中异常表达，在一定条件下，通过一定的手段改变HOX基因的表达水平可以促进或者抑制白血病的发生、发展。利用RNA干扰技术能够特异性地抑制癌基因、癌相关基因及突变基因的过度表达，使这类基因保持在沉默或者休眠状态，从而有望使用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。已有研究证明利用特异siRNA抑制BCR-ABL的表达、AMLl/ MTG8 基因表达或 C-raf 基因表达，可以导致白血病细胞凋亡增多，同时增强对药物的敏感性，为利用RNAi 有效靶向治疗白血病提供了新的思路。

尹宝慧等构建HOXA7基因的特异性真核表达载体 （pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7）及阴性对照载体（pGPU6/GFP/Neo-shNC）分别转染U937细胞（人白血病细胞）， 运用RT-PCR和蛋白质印迹法分别在mRNA和蛋白质水平检测各组细胞中HOXA7的表达情况， MTT法检测各组细胞对阿糖胞苷（cytarabine， Ara-C）和高三尖杉酯碱 （homoharringtonine， HHT） 的敏感性。结果显示：实验组（转染真核表达载体的U937细胞） HOXA7-mRNA /蛋白的相对表达量明显低于对照组， 且实验组细胞对 Ara-C和HHT的敏感性增加，提示：运用RNAi技术抑制HOXA7表达，在一定程度上可逆转白血病细胞的多药耐药性。贾秀红等，也证实甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）联合RNAi干扰，U937细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均明显高于RNAi组或MTX组， 说明RNAi 抑制HOXA7 表达能增强 U937 细胞对 MTX 的敏感性，因此 RNAi 抑制 HOXA7 联合MTX 有望成为白血病基因治疗的新的靶点。

  YuriP等应用RNA干扰技术发现了与慢性淋巴细胞白血病有关的2个miRNA(即miR181和miR29)，这2个miRNA可以抑制TCL1基因的表达，为未来慢性淋巴细胞白血病的治疗奠定了基础。RNAi慢病毒稳定沉默HOXA9基因的表达可在一定程度上提高U937细胞对化疗药物长春新碱和肉红霉素的敏感性和增加细胞凋亡率。Xiong等报道了siRNA干扰沉默HOXA9基因使急性白血病K562细胞凋亡率明显升高，表明HOXA9基因在人白血病的发生发展中起到重要作用，它有可能成为白血病分子水平靶向治疗的新位点。Jia等[37]报道了RNA干扰同源盒A10基因表达可逆转白血病K562细胞多药耐药性，以HOXA10基因为靶标构建的shRNA表达载体能明显增强VCR和VP-16对K562细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用。提高白血病细胞对化疗药物的敏感性。提示HOXA10基因表达被RNA干扰可以在一定程度上逆转白血病细胞的多药耐药性。HOXA5的表达主要局限在粒单核细胞系，在多能祖细胞阶段HOXA5就能促使造血干细胞或造血祖细胞从红系转向粒系分化发展。HOXA5基因在Jurkat细胞中也呈高表达。已有研究表明，用于RNAi技术抑制HOXA5的表达能抑制肿瘤的发生。

5 RNA干扰技术的应用前景

  RNA干扰技术能快速、特异地进行基因沉默，为我们进行基因功能及基因治疗的研究，探索白血病的病因及治疗方法提供了新途径。RNA干扰技术仍有不足之处，如何能在临床应用中有效地把siRNA导入细胞或者人体内目前是个难题，虽然如今已经发展很多新技术促使此问题的解决方案展露头角，但并未从跟不上克服该难题，同时RNAi具有严重的不良反应，导致了临床应用的局限性。但我们相信， 随着分子生物学的发展以及对RNAi现象的深入了解， 这些难题最终一定会被攻克，RNAi技术必将成为白血病治疗的有效手段。

                          参考文献 

[1]. Mcginnis W,Levine MS,Hafen E,et al.A conserved DNA sequence in homeotic genes Of the drosophilia an tennapedia and bithorax complexes  [J].Nature,1984,308(5958):428-433

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