秦岭龙胆抗炎镇痛活性研究[1]

秦岭龙胆抗炎镇痛活性研究[1]

冯苗苗,高建,许海燕*

陕西国际商贸学院 医药学院，陕西 咸阳 712046

摘要：目的：对秦岭龙胆的体内外抗炎镇痛活性进行研究。方法：采用盲肠结扎穿孔实验和LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞炎症评价秦岭龙胆的抗炎活性；在动物实验中，采用热板实验验证秦岭龙胆的镇痛作用。结果：实验表明，秦岭龙胆能显著抑制由脂多糖诱导的巨噬细胞NO的释放和盲肠结扎穿孔实验抑制的炎症反应，并能明显提高小鼠的痛阈值。结论：秦岭龙胆具有较强的抗炎镇痛活性。

龙胆科是龙胆属植物中最大的家族，遍布世界各地[1]。在我国，该种属植物有二百余种[2]。在中国传统要用植物中，龙胆属植物具有很多的药理活性。龙胆属的根和根茎是治疗黄疸、肺炎、便秘、疼痛和咳嗽的重要来源[3-5]。在体内和体外的研究报道中指出，龙胆属具有抗氧化、抗炎、镇痛等特性[6]。但秦岭龙胆的成分及其抗炎活性研究至今未见报道。本研究采用水煎法对秦岭龙胆进行了提取，并采用体内外炎症实验模型研究秦岭龙胆的抗炎、镇痛的药理作用。

1 材料和仪器

1.1实验药物

秦岭龙胆(Gentiana apiata N. E. Brown)药材自采于陕西省眉县太白山脉，经陕西国际商贸学院医药学院雷国莲教授鉴定为秦岭龙胆的全草。

1.2细胞株与动物

巨噬细胞 RAW264.7 购自中科院上海细胞库; 5～6周龄洁净级健康昆明种雄性小鼠，体重20±2g，由西安交通大学动物实验中心提供，动物生产许可证号: SCXK (陕) 2018-003。

1.3主要试剂

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）、NO检测试剂盒购自碧云天公司； TNF-α、IL-6、IL-10检测试剂盒由美国R＆D公司生产；DMEM高糖培养基、胰酶、小牛血清均购自Gbico公司；地塞米松Lipopolysac-charide( LPS)购自Sigma公司。

1.4主要仪器

电子天平、酶标仪、超净工作台、细胞培养箱、热板。

2 方法

2.1供试品的制备

准确称取粉碎后的秦岭龙胆粉末，置于烧杯中加水，煎煮3次/30min，合并滤液浓缩至0.3g/mL，即得供试品溶液。

2.2细胞培养及分组

小鼠巨噬细胞 RAW264.7加入含有 10 % 的胎牛血清( FBS)、青霉素和链霉素的DMEM 高糖培养基置于5 % CO2，37 ℃培养箱中培养。待细胞状态稳定后，将细胞接种于96孔板，1 × 105细胞/孔，每孔100μl。按实验要求将细胞分为：空白对照组: DMEM培养; LPS 组: 10μg/ml LPS; LGAEO组：5μg/mL GAEO +10μg/ml LPS；HGAEO组：25μg/mL GAEO +10μg/ml LPS; 铺板24 h 后弃掉培养液，加入新的培养液及药物和 LPS ( 10 μg /ml) 。置 5% CO2 培养箱中37 ℃继续培养24 h。

2.3 CCK8法测定细胞活力

将细胞接种于96孔培养板内，1 × 105细胞 /孔，每孔100μl，置于5% CO2培养箱37 ℃培养 24h后，加入5 μg/mL、25μg /ml的供试品溶液（对照组加正常培养液），每组均设6个复孔。继续培养24h后，向每个孔中加入10μl CCK8溶液，放入培养箱继续培养1h，用酶标仪测定在450nm出的吸光值。

2.4 NO含量测定

将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，接种于96孔板内，1 × 105细胞/孔，每孔100μl。培养 24h 后加入供试品至终浓度5、25μg /ml，并加入 10 μg /ml LPS; 同时设立空白对照组和模型组，每组设6个平行孔，继续培养 24 h。向每孔中加入50μl Griess reagent I与50μl Griess reagent II试剂，放置于室温10 min。然后用酶标仪测定 540nm 处各孔的吸光值。

2.5盲肠结扎穿孔试验

将60只小鼠， 随机分成 6组，每组10只，分为假手术组（sham）、模型组（model）、阳性对照组( DEX)、供试品高剂量组（HGAEO150 mg /kg）与低剂量组（LGAEO），阳性对照组（10mg/kg地塞米松）DEX)，各组均腹腔注射药物。模型建立后，进行腹腔注射，连续给药7天。第8天于眼球取血后处死小鼠，收集的血液静置30min后离心获取血清，ELISA检测各组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6热板法实验

各组小鼠连续给药7天，末次给药1小时后，分别将其置于55 ±5℃热板上测定痛阈值。计算小鼠痛阈提高率。

痛阈提高率=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100%

3结果

3.1秦岭龙胆对RAW264.7细胞生长的影响

CCK8检测法结果显示秦岭龙胆供试品5μg/ml、 25μg/ml 对RAW264.7细胞没有明显的细胞毒性。即在该实验条件下，该剂量对细胞没有毒性，该实验具有可行性，结果如图1。

图1秦岭龙胆对RAW264.7细胞生长的影响

3.2秦岭龙胆对RAW264.7细胞NO释放的影响

实验结果如图2所示，与空白对照组（C）相比，模型组（LPS）的NO释放明显增多，提示该实验模型建立成功。与模型组组相比，秦岭龙胆供试品可以明显抑制LPS引起RAW264.7细胞释放NO的释放量。且25μg/ml秦岭龙胆供试品（HGAEO）的抑制作用更为显著，抑制率达到61.7%，表明秦岭龙胆在体外具有明显的抗炎活性。

图2秦岭龙胆对RAW264.7细胞中NO含量的影响

3.3秦岭龙胆对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的含量

实验结果如表1所示，与假手术组（sham）相比，模型组（model）血清中的TNF-α、IL-6、IL-10含量明显升高，提示该实验模型建立成功。与模型组相比，秦岭龙胆可以明显抑制小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的含量。实验结果表明秦岭龙胆在体内具有显著的抗炎效果。

 治疗后各组小鼠中TNF-α、IL-6 和IL-10含量的比较（±s）

注:与Sham组相比，a P＜0. 01;与Model组比较，b P＜0. 05、c P＜0. 01

3.4秦岭龙胆提取液对热板致小鼠疼痛的影响 

实验结果显示，与假手术组相比，秦岭龙胆高、低剂量组痛阈值明显升高( P＜0. 05)。高剂量组150mg/kg的秦岭龙胆提取液使小鼠痛阈提高60.37%，表明给予药物后能明显抑制热板所致的疼痛，与阳性对照药地塞米松组 (63.24%) 作用相当，低剂量组的痛阈提高率为 30.41%。

4.讨论

   龙胆的化学成分主要为环烯醚萜类化合物，具有抗炎镇痛、健脾利胆、抗氧化等药理作用，目前临床上用于治疗肺炎、感冒等病症，具有良好的效果。

    有研究表明，呼出气NO对于评估慢性阻塞性肺疾病气道炎症具有重要作用。在急性炎症反应中，NO作为调节病理过程中的介质，极少的 NO为体内稳态平衡起重要作用。在病理情况下，诱导型 NO 合成酶合成大量的 NO ，加重炎症反应的发生[7-8]。因此，在本研究当中测定 RAW264.7 细胞所释放的 NO含量对评价秦岭龙胆的抗炎活性意义重大。如图2所示，秦岭龙胆对巨噬细胞NO的生成具有明显的抑制作用，且表现出剂量依赖性。其原因可能是因为一氧化氮合酶的活性受到抑制。

参考文献

[1]太白县地方志编纂委员会. 太白县志(1990~2010)[M].陕西三秦出版社:陕西地方志丛书, 201710.1108.

[2] 任雪. 龙胆道地性形成生境机制研究[D].辽宁中医药大学,2021.

[3] 陈琳. 制坚龙胆的化学成分研究[D].昆明理工大学,2019.

[4] 李跟旺,王磊. 秦艽在关节炎抗炎镇痛治疗中的作用[J]. 西部中医药,2018,31(03):133-136.

[5] 田先娇,党菱婧,梁建平,等. 德宏州景颇族传统药用植物民族植物学研究[J]. 中国野生植物资源,2021,40(08):70-78.

[6] 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 上－下气道慢性炎症性疾病联合诊疗与管理专家共识[J]. 中华医学杂志,2017,97(26):2001-2022.

[7] 周伟. 滇龙胆龙胆苦苷生物合成三个基因克隆、表达及与龙胆苦苷积累的相关性研究[D].云南中医学院,2017.

[8] 王东,杨欣燐,田琳娟,等. 苏黄止咳汤对咳嗽变异性哮喘患者IL-6,TNF-α的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2017,23(02):164-168.

1.基金项目：1.陕西省科技厅项目（2021SF-365）2.陕西省教育厅青年创新团队建设科研计划项目（21JP011）3.国家级大学生创新创业训练计划项目(S202113123008)。

2.作者简介：冯苗苗（1998-），女，本科生。

3.通讯作者：许海燕(1977-)，女，硕士，副教授，研究方向：中药药效物质基础研究。