白花蛇舌草、半枝莲、山慈姑含药血清对人胃癌SGC7901细胞侵袭迁移影响的研究*

白花蛇舌草、半枝莲、山慈姑含药血清对人胃癌SGC7901细胞侵袭迁移影响的研究*

吴易超1，冯飞雪1，罗璐1，杨攀2，侯俊明**

1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000：2.西安医学院第一附属医院，陕西 西安 710003：**.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000

摘要目的：研究中药角药对人胃癌SGC7901细胞肿瘤迁移侵袭能力影响作用及其可能机制；方法：采用半枝莲、白花蛇舌草、山慈菇组成的角药，分为中药角药高、中、低剂量组、空白组采取灌胃，氟尿嘧啶组腹腔注射，制备含药血清干扰人胃癌SGC7901细胞培氧；细胞划痕实验含药血清对人胃癌SGC7901细胞迁移能力的影响；Western Blot检测各组血清干预培养缺氧诱导后各组细胞中HIF-1α、uPA、uPAR蛋白的表达；结果：细胞划痕实验显示，氟尿嘧啶与角药血清干扰人胃癌SGC7901细胞后其细胞划痕愈合时间较慢，氟尿嘧啶与角药血清干扰人胃癌SGC7901细胞后的迁移距离较空白组干扰培养更短（p<0.05），且角药高浓度较角药低浓度的迁移距离更短（p<0.05）；Western Blot显示各组血清干预培养后缺氧组的各组血清干预培养后细胞中HIF-1α、uPA、uPAR蛋白的表达均较空白组更低（p<0.05），且角药高浓度较角药低浓度的表达量更低（p<0.05）；结论：不同剂量的中药角药均能够抑制人胃癌SGC7901细胞肿瘤迁移侵袭能力，且高剂量抑制作用更明显，抑制作用机制可能与降低HIF-1α/uPAR的表达有关。

关键词：HIF-1α/uPAR；中药角药；胃癌SGC7901细胞；迁移侵袭能力

胃癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，其中侵袭和转移影响着肿瘤的发展，同时也决定着胃癌的治疗和预后[1]。现代医学研究表明，侵袭及转移是恶性肿瘤中多基因与多因子共同参与调控的过程，肿瘤细胞从原发灶到局部转移再到远处转移，由多基因参与调控。根据中医学古籍记载，胃癌当属“胃脘痛”、“噎膈”等病范畴，认为正虚与邪实是其发病的两个重大因素。目前中药研究显示，中药的某些成分可以抑制肿瘤细胞的侵袭转移，抑制机理多为干预癌细胞迁移、黏附、细胞外基质的降解、血管生成、肿瘤微环境等，但这些研究均缺乏深入到与肿瘤侵袭迁移相关的基因层面，且仅仅局限于某一单类药物及其活性成分的研究[2-3]。因此，本研究团队根据多年的临床经验以及实验、科研等研究总结，并依据文献古籍，以及中药单药抗肿瘤研究，发现多数清热解毒药在体外实验条件下均具有抗肿瘤作用，因此，依据中药相须配伍原则，确定了山慈姑、半枝莲、白花蛇舌草各15g的辩证组方，并且其在对延缓胃癌患者转移过程中取得了确切的疗效，并取得了临床应用推广，由此本课题组提出“中药角药”理论。根据古籍文献记载，“角药”最早可追溯于《素问·至真要大论》，其中“君一臣二，奇之制也”；又于《伤寒杂病论》中广泛使用，如四逆汤（附子-干姜-甘草）、小青龙汤（干姜-细辛-五味子）等古今名方沿用至今[4-7]。其次，现代药理学研究发现山慈菇、半枝莲及白花蛇舌草均能抑制肿瘤增值、侵袭及转移。于是本团队设计本次实验，研究其是否通过HIF-1α通路发挥其抗肿瘤作用及其可能机制。

1.材料与方法

1.1材料

本次研究所用到的主要试剂与材料有SD大鼠50只（体重220±20g）、中药角药、人胃癌SGC7901细胞株、胎牛血清、胰蛋白酶、HIF-1α及uPAR抗体、一抗二抗等。

1.2方法

1.2.1含角药血请的制备

    中药药液制备：中药角药组方为：山慈姑15g；半枝莲15g；白花蛇舌草15g；取上述药文火煎0.5小时，滤过调整浓度至8.4g/ml、4.2g/ml、2.1g/ml，50mL分装，4℃保存备用。

    大鼠饲养：清洁级SD雌性大鼠50只，体重220±20g，随机分为空白组、5-Fu组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，分笼常规饲养。

含药血清制备：大鼠适应性饲养1周后开始用药，每天1次（空白组不给药；5-Fu组按0.0025g/kg腹腔注射给药，一次0.7-1ml，高中低剂量组分别按照（16.2g/kg、8.4g/kg、4.2g/kg）灌胃2ml，连续给药1周，末次给药1h后，获得5组大鼠含药血清，置-20℃冰箱保存备用。

1.2.2细胞培养及中药角药等干扰

细胞培养及传代：采用人胃癌SGC7901细胞系，培养与标准培养基中（胎牛血清、双抗、RPMI-1640细胞培养液），置于恒温培养箱（37℃、5%CO2），按1:2比例传代。随机分为白组、5-Fu组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，并依次加入等量各组含药血清。

1.2.3细胞缺氧处理

选取对数生长期细胞，分为空白组，氟尿嘧啶组，中药高、中、低剂量组，放置于37℃低氧环境培养箱中（N2浓度为94%，CO2浓度为5%，O

2浓度为1%）培养。

1.3指标检查方法

细胞划痕实验：①操作前，灭菌直尺和标记笔于超净台内消毒30min，②先用标记笔在6孔板背后，均匀划5条线。③在孔中加入约3×10５个细胞。④于24h后用枪头比着直尺，垂直于孔底画横线划痕。⑤用PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞，分别加入各组含药血清及无血清培养基。⑥放入培养箱培养，按6、12、24小时取样，拍照。重复三次。⑦采用photoshop对图片处理后进行迁移距离的测量。

Western印迹检测蛋白表达：①取满足实验要求细胞，常规24h。②加裂解液（细胞:裂解液=1:10）后，裂解30分钟。③离心（12000rpm，5min），后取上清液备用。④BCA法测定样品蛋白浓度，于酶标仪测定562nm波长处的OD值，绘制标准曲线，蛋白变性后，按上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育步骤实验。⑤将PVDF膜平铺于暗室中，加入等体积ECL发光液的A、B试剂混合后，反应1min后，曝光，采集图像分析显影，最后用Quantity One4.6.2软件分析。

1.4统计学方法

本次研究所有数据，均采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料采用t值检验，计数比较卡方x2检验，检验标准a=0.05，当p<0.05表示有统计学意义。

2.结果

2.1 细胞划痕实验结果

对人胃癌SGC7901细胞采用不同药物进行干扰后，经细胞划痕实验所测得的其迁移距离统计见下表1所示

表1：各组SGC7901细胞受干扰后迁移能力的影响（x_±s，μm）

（注：空白组与其余各组迁移距离相比，具有统计学差异，△p<0.05；氟尿嘧啶组与低剂量组、中剂量、高剂量组迁移距离相比，具有统计学差异，▲p<0.05）

由上表可见，经中药角药和氟尿嘧啶对人胃癌SGC7901细胞干扰后，其迁移能力下降，其中药角药浓度越大，其干扰能力越强。

2.3 Western Blot对各组HIF-1α、uPA、uPAR蛋白表达量检测结果

各组细胞在缺氧状态下培养后，经Western Blot检测其HIF-1α、uPA、uPAR蛋白表达量结果见下表3所示：

表3：Western Blot对各组HIF-1α、uPA、uPAR蛋白表达量检测结果（x_±s）

（注：空白组与其余各组HIF-1α、uPA、uPAR蛋白表达量相比，具有统计学差异，△p<0.05；氟尿嘧啶组与低剂量组、中剂量、高剂量组HIF-1α、uPA、uPAR蛋白表达量相比，具有统计学差异，▲p<0.05）

3.讨论

胃癌因其恶性程度高，具备恶性肿瘤所有特征，研究发现，侵袭及转移主导着肿瘤的进展，其中外基质降解、新生血、肿瘤微环境等与侵袭和转移密切相关，胃癌也是如此。众多研究表明，HIF-1α/uPAR的表达对消化道肿瘤的转移和侵袭起着重要的调节作用[8]。目前研究认为HIF-1α主要参与以下几个过程：①促进肿瘤血管形成；②促进红细胞生成；③支持肿瘤能量代谢；④调控细胞周期；⑤影响细胞分化；⑥影响肿瘤细胞凋亡等[9]。兰梅[10]等通过在各种胃癌细胞株对HIF-1α的表达进行检测时发现，多种胃癌肿瘤细胞株中均有HIF-1α的表达，同时SGC7901细胞在常氧状态下即能表达一定量的HIF-1α，而在缺氧状态下则表达更多。

传统医学认为“胃癌”病机为正虚与邪实是胃癌发病的两个重大因素。现代中医认为脾胃虛弱，正气内虚为根本原因，同时包括气滞、血瘀、痰凝等病理产物凝结。周仲瑛教授提出的“癌毒学说”，主张“抗癌解毒”治疗原则[11]，因此清热解毒药成为了研究热点。目前应用清热解毒法来治疗胃癌在临床的应用颇多，例如本研究选取白花蛇舌草、山慈菇、半枝莲。山慈菇、半枝莲、白花蛇舌草均具有热解毒，三药合力，共著清热解毒、抗癌消瘤之功。现代研究显示山慈菇、半枝莲及白花蛇舌草具有抗肿瘤作用，并可在肿瘤微环境中发挥作用，其中研究表明山慈菇、白花蛇舌草、半枝莲都可能是通过激活免疫系统以达抗肿瘤作用[12]，其次三药及其提取物抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移以及增强机体免疫力作用[13-14]。

本次实验研究发现，首先，划痕实验中，通过分析各组细胞迁移率，发现中药角药各剂量组均可抑制胃癌细胞迁移，但中药组作用均较氟尿嘧啶组弱，并出现浓度依赖性，差异具有统计学意义（p<0.05）。Western blot实验检测与空白组对比，发现各中药组及氟尿嘧啶组均可有效的明显抑制HIF-1α、uPA、 uPAR蛋白的表达，但中药组在抑制HIF-1α/uPA、uPAR蛋白表达方面不及5-Fu组，且高、中、低中药组作用具有浓度依赖性，差异具有统计学意义（p<0.05）。上述两个实验说明了在体外缺氧微环境中，中药角药可作用于HIF-1α缺氧信号通路，抑制HIF-1α的表达，进而抑制了HIF-1α/uPA、uPAR蛋白的表达，以达到抑制人胃癌SGC7901细胞侵袭转移的作用。

在本次研究中，即采用山慈姑、半枝莲、白花蛇舌草的角药组方对胃癌SGC7901细胞进行干扰，以探讨其对胃癌肿瘤细胞的迁移侵袭影响的可能机制。研究发现，通过细胞划痕实验比较不同干扰组别的SGC7901细胞的迁移和侵袭能力的变化发现：角药组方能对SGC7901细胞的迁移、侵袭起到抑制作用，且与不进行干扰相比存在着较大差异；而与常规化疗药物氟尿嘧啶相比，高剂量的角药组方对SGC7901细胞的迁移、侵袭能力的影响更大。研究发现角药血清干扰后的SGC7901细胞的HIF-1α、uPA、uPAR表达量下降，这表明由山慈姑、半枝莲、白花蛇舌草组成的角药组方可能通过下调HIF-1α、uPAR的表达来抑制人胃癌SGC7901细胞的迁移、侵袭能力。

综上所述，不同剂量的中药角药均能够抑制人胃癌SGC7901细胞肿瘤迁移侵袭能力，且高剂量抑制作用更明显，且具有浓度依赖性，抑制作用机制可能与降低HIF-1α/uPAR的表达有关。

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