二氧化氯对金黄色葡萄球菌的杀菌效果研究

二氧化氯对金黄色葡萄球菌的杀菌效果研究

叶萌

西安市阎良区市场监督管理局 陕西省西安市 710089

摘要：将金黄色葡萄球菌活化，采用平板计数法，用不同浓度的二氧化氯溶液涂布，观察对金黄色葡萄球菌的抑制效果。无二氧化氯水溶液的平板菌落生长正常，随二氧化氯的浓度增加，对金黄色葡萄球菌菌落的杀菌效果明显。

关键词：金黄色葡萄球菌；二氧化氯；杀菌

1 引言

1.1 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，人进食被它污染的食物1~5小时后，会出现急性胃肠炎的症状，表现为恶心、呕吐和腹泻。金黄色葡萄球菌在干燥和高温环境下都可存活，加热70℃1小时，80℃30Min，不被杀死，可耐低温，在冷冻食品中不易死亡。

金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是世界性卫生问题，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%，中国每年发生此类事件也非常多。金黄色葡萄球菌作为一种重要的实验性致病菌，它对食品加工业及人类的将抗存在潜在的危害，因此，对金黄色葡萄球菌灭方法的的研究是食品工业的重要课题[1]。

1.2 二氧化氯

二氧化氯(ClO2)是一种无毒无害、高效广谱性强氧化型杀菌剂，具有杀范围广、效果好、作用时间短、剂量小、无毒等特点。相关研究结果表明，二氧化氯不与有机物产生氯代作用，不会生成被认为可以致癌的氯甲烷等[2]。二氧化氯是一种不产生致癌物的广谱环保型杀菌消毒剂，具有杀菌能力强、对人体及动物没有危害等优点［3］。能杀灭几乎所有常见的微生物，且不易产生抗药性，其杀菌作用可能基于较强的氧化能力。

2 试验方法

2.1 培养基的配制

按培养基配方比例依次准确地称取2.5g蛋白胨，1.5g牛肉膏，2.5g NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分至500ml。配制固体培养基，重复上述步骤，将称好的7.5g琼脂分放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。

培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，并将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。放入高压灭菌锅，0.10MPa(121℃)高压蒸汽灭菌15min。

2.2金黄色葡萄球菌活化

活化菌种.取接菌环，在酒精灯的火焰上灭菌，挑取纯化提取的金黄色葡萄球菌菌种，放入装有灭菌冷却的液体培养基的三角瓶，培养箱中38℃恒温培养24小时。

2.3 二氧化氯水溶液制备

根据化学反应式：5NaClO2＋C6H8O7=4Na3C6H5O7＋12ClO2+3NaCl+6H2O，在分液漏斗及2号气瓶中加满NaClO2溶液，1号气瓶中加入柠檬酸，其他气瓶中则加满冰水。连接好各瓶之间的胶管并抽真空；打开分液漏斗旋钮，让NaClO2缓慢滴入1号气瓶，在反应过程中，1号气瓶中的颜色反应为黄色，2号气瓶中颜色应为红褐色。如果2号气瓶中的颜色变为淡黄色，则需增大或减小的NaClO2滴入速度；当1号气瓶加满后，则停止反应将3号瓶中的ClO2溶液倒入棕色瓶并存放于冰箱中备用，将4号瓶前移至3号瓶位置，即可重复上述反应继续制取ClO2溶液,并对其浓度进行测定及标记。

2.4不同浓度二氧化氯水溶液抑菌试验

稀释：先用紫外线对无菌操作台杀菌30分钟，在无菌操作台操作时要用75%浓度的酒精对手净行消毒。

取6支盛有4.5ml无菌水的试管，排列在试管架上并，用记号笔依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，用1ml的无菌吸管精确地吸取0.5ml金黄色葡萄球菌悬液放入10-1的试管中。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。

另取一只吸管自10-1试管吸取0.5ml放入10-2试管中，吸吹三次，另取一只吸管自10-2试管吸取0.5ml放入10-3试管中，吸吹三次，另取一只吸管自10-3试管吸取0.5ml放入10-4试管中，吸吹三次，另取一只吸管自10-4试管吸取0.5ml放入10-5试管中，吸吹三次，另取一只吸管自10-6试管吸取0.5ml放入10-6试管中，吸吹三次。

倒平板：先将从高压灭菌锅中取出的固体培养基，趁热倒入无菌的平板中约15ml,置平皿于水平位置迅速旋转，使培养基平铺在平皿上均匀，待凝固。并标号5-1、 5-1、5-1、5-2、5-2、5-2、5-3、5-3、5-3、5-4、5-4、5-4、5-0、5-0、5-0、6-1、6-1、6-1、6-2、6-2、6-2、6-3、6-3、6-3、6-4、6-4、6-4、6-0、6-0、 6-0，然后用1ml无菌吸管吸取10-5中的菌液0.1ml，分别滴到5-1、5-1、5-1、5-2、5-2、5-2、5-3、5-3、5-3、5-4、5-4、5-4、5-0、5-0、5-0平皿上，再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，换新的无菌吸管吸取10-6中的菌液0.1ml，分别滴到6-1、6-1、6-1、6-2、6-2、6-2、6-3、6-3、6-3, 6-4、6-4、6-4、6-0、6-0、6-

0的平皿上，再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内。

加二氧化氯水溶液：将四种浓度的二氧化氯水溶液，用移液枪移取0.1ml，加入各浓度的培养基中，用涂布棒涂均匀。不同浓度的菌体不同浓度的二氧化氯溶液做三组平行试验，移取不同浓度的溶液要换无菌吸管。

然后将平板倒转，放入恒温培养箱中38℃培养24小时，观察菌落计数。

3 结果与分析

3.1 金黄色葡萄球菌活化结果

金黄色葡萄球菌经2代活化培养，得到菌体均匀的菌悬液。使最后的菌悬液所含活菌量在6.7×109 cfu/ml。

3.2 二氧化氯水溶液浓度的测定结果

用碘化法测二氧化氯水溶液的浓度，测得浓度为1.8%，水溶液共100ml。用无菌水稀释制得的二氧化氯水溶液，原液分别按5倍、20倍，50 倍100倍进行稀释，将容量瓶定容 ，得到浓度为0.36%、0.09%、0.036%、0.018%的二氧化氯水溶液，在容量瓶上做标记。

3.3不同浓度二氧化氯水溶液抑菌试验结果

观察培养基，金黄色葡萄球菌的生长情况，如下图所示（稀释菌液浓度：前为10-5，后为浓度为10-6)

图1二氧化氯水溶液浓度为0.018%图2二氧化氯水溶液浓度为0.036%

图3二氧化氯水溶液浓度为0.09%图4二氧化氯水溶液浓度为0.36%

金黄色葡萄球菌培养菌落数见表1：

表1 样品菌落数

4结果

实验表明二氧化氯对金黄色葡萄菌存在抑制作用。二氧化氯对金黄色葡萄球菌的杀菌效果，是随水溶液浓度的增加而增加的［4］。浓度为0.36%、0.09%、0.036%、0.018%的二氧化氯水溶液对金黄色葡萄球菌的生长都存在一定影响，且影响效果随二氧化氯水溶液浓度的增大而依次变大，浓度为0.9%二氧化氯水溶液，可以完全有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。

参考文献

[1]杨洋，张伟。袁耀武，钟晓英，马雯，PCR检测乳中金黄色葡萄球菌[J]，中国农业科学2006，（5）：98.

[2]田卫，李军，李新华,二氧化氯（ClO2）对苹果表面金黄色葡萄球菌杀菌规律的研究 [J]，食品研究与开发，2006（1）：43-45.

[3]孙燕，贠洪艳. 新一代的杀菌消毒剂二氧化氯［J］. 黑龙江医药，2002，(4) ：78

[4]晋日亚，胡双启，气体二氧化氯对葡萄表面细菌杀菌规律研究[J]，中国安全学报2008（5）:98—10.