植物甾醇清除自由基能力研究

植物甾醇清除自由基能力研究

许腾1陈文洁2靳志敏3原梦婕4李鹏亮5

内蒙古自治区市场监督管理审评查验中心内蒙古呼和浩特市010010

摘要：植物甾醇主要来源于油脂下脚料，是一种潜在的天然抗氧化剂和功能性因子。自由基与人类衰老有关[1]。对植物甾醇清除自由基能力进行测定，采用邻二氮菲法、邻苯三酚自氧化法和DPPH自由基法，以BHT和VE为对照，测定植物甾醇清除自由基的能力，为其清除自由基活性的研究提供理论参考和实践依据。

关键词：植物甾醇 自由基 清除能力

SNT 2360.5-2009《进出口食品添加剂检验规程第5部分：抗氧化剂》[2]定义，食品抗氧化剂（Antioxidant）是指能防止或延缓油脂或食品成分氧化、分解、变质，提高食品稳定性的物质。按照其来源可分为天然抗氧化剂和合成抗氧化剂。常见的天然抗氧化剂有苯酚类、黄酮类、多糖类等，人工合成抗氧化剂有丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）、没食子酸丙酯（PG）等。人工合成抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用[3]，天然抗氧化剂受到广大消费者关注，成为油脂化学和生物学研究热点。

人体内的氧自由基约占自由基总量的95%，包括羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O2－）、过氧化氢分子（H2O2）等，统称为活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）[4]。实验室常用方法是在体外模拟生成ROS，根据抗氧化剂的清除能力测定活性大小。除ROS外，1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）也作为评价抗氧化能力的指标之一[5]。郭雪峰[6]等利用Fenton反应产生·OH，测定竹叶提取物样品清除·OH能力，发现抗氧化能力接近人工合成抗氧化剂TBHQ，可作为天然抗氧化剂开发。展跃平[7]等从橘渣中提取类黄酮物质，研究对DPPH·和O2－·的清除效果，结果橘渣中的类黄酮物质对DPPH·和O2－·均有剂量效应清除效果，对DPPH·的清除作用更好。

测定植物甾醇（Phytosterol or Plant Sterol）清除自由基的能力，以二丁基羟基甲苯（BHT）和VE为对照。结果表明，植物甾醇对羟基自由基（·OH）的半数清除浓度（IC50）0.28mg/mL；对超氧阴离子自由基（O2－·）的IC50 0.07mg/mL；对1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的IC50 0.80mg/mL；清除能力随质量浓度的增加而增强。

1.植物甾醇清除羟基自由基能力测定

1.1实验原理

应用邻二氮菲-Fe2+氧化法（Fenton）测定目标化合物对羟基自由基（·OH）的清除能力[8]。Fenton反应是指邻二氮菲与Fe2+反应生成橙红色的[Fe(C12H8N2)3]2+络合物，该物质在λ=536nm处有最大吸收；加入H2O2后，Fe2+催化H2O2产生具有强氧化能力的·OH，[Fe(C12H8N2)3]2+被氧化为[Fe(C12H8N2)3]3+，λ=536nm处消失或减弱。加入·OH清除剂，经Fenton反应产生的·OH被清除，可通过测定A536nm值比较抗氧化剂清除·OH的能力。

1.2实验步骤

采用Fenton法，按表1加样，37℃恒温水浴40min，在λ=536nm处测定吸光度，以BHT和VE为对照。表1中A（A1~A5）为加入植物甾醇的羟基自由基体系（即邻二氮菲-Fe2+ +H2O2+植物甾醇）的吸光度；Ai为加H2O2的羟基自由基体系（即邻二氮菲-Fe2+ +H2O2）的吸光度；A0为羟基自由基反应体系中不加H2O2（即邻二氮菲-Fe2+）的吸光度值。

植物甾醇对·OH的清除率可按下列公式计算：

表1  Fenton体系加样量

2.植物甾醇清除超氧阴离子能力测定

2.1实验原理

邻苯三酚在弱碱性（Tris-HCI缓冲溶液，pH8.2）环境中自身氧化分解产生O2－·和有色中间产物，O2－·对自氧化也起到催化作用，有色物质在λ=320nm处有最大吸收光；在体系中加入清除O2－·的物质，会减少有色物质的生成，使吸光度降低。吸光度越低，O2－·的清除效果越好。

2.2实验步骤

采用邻苯三酚自氧化法，见表2，25℃恒温水浴40min，在λ=320nm处测定吸光度，以BHT和VE为对照。表2中，A0为不加入样品，只加入邻苯三酚和缓冲液的吸光度值；A（A1~A5）为加入植物甾醇的吸光度值；设置使用无水乙醇代替邻苯三酚，目的消除试样自身在λ=320nm下的吸收。植物甾醇清除O

2－·的能力测定，可按下列公式计算：

表2  抑制邻苯三酚自氧化加样表

3.植物甾醇清除DPPH自由基能力测定

3.1实验原理

DPPH·在乙醇溶液呈深紫色，能够接受一个电子或氢离子。DPPH乙醇溶液在λ=517nm处具有最大吸收光，加入自由基清除剂，DPPH·的单电子被捕捉，紫色变橙色，吸光值下降；试验样品抗氧化能力吸光度越小，自由基清除能力越强。

3.2实验步骤

DPPH自由基清除体系加样量见表3，反应10min后1cm比色皿在λ=517nm处测定吸光值，以BHT和VE为对照。表3中，A0为DPPH溶液与无水乙醇测得的吸光度值；Ai为乙醇与植物甾醇溶液测得的吸光度值；Aj（A1~A5）为DPPH溶液与配成系列浓度的植物甾醇溶液测得的吸光度值。可按下列公式计算：

表3  DPPH实验加样量

4.结果与讨论

4.1植物甾醇对羟基自由基的清除作用

有氧自由基中·OH对人体细胞的危害最大，直接破坏大分子物质和生物膜，造成糖蛋白、脂蛋白损伤，导致疾病发生。通过Fenton体系，测定植物甾醇清除·OH能力，三种抗氧化剂对均有清除作用，清除能力随浓度的增加逐渐增强。植物甾醇半数清除率对应样液浓度IC50为0.28mg/mL，BHT和VE在浓度为0.32mg/mL处清除率达到50.37%和53.95%。植物甾醇清除·OH的效果最好，BHT和VE相差不大。

4.2植物甾醇对超氧阴离子的清除作用

超氧阴离子是人体内常见的自由基，对人体有双重性质，总量少时，它可杀死部分进入人体的有害菌；体内大量聚集，会对健康细胞有破坏作用，促使肌体衰老，引起中风等疾病。植物甾醇、BHT、VE均表现出良好的清除效果，且随浓度升高而增强。三种抗氧化剂半数清除浓度分别为：植物甾醇0.07mg/mL，BHT0.09mg/mL，VE0.13mg/mL。

4.3植物甾醇对DPPH自由基的清除作用

DPPH·是一种很稳定的自由基，样品清除自由基从而使降低DPPH·浓度下降。 BHT对DPPH·清除效果最好，在样品浓度为0.50mg/mL时达到半数清除；VE次之， IC50为0.60mg/mL；植物甾醇清除DPPH·的IC50为0.80mg/mL。

总结

实验以BHT和VE对照，考察植物甾醇对自由基的清除能力。结果表明：

(1)植物甾醇清除·OH的IC50为0.28mg/mL，BHT和VE均为0.32mg/mL，清除·OH能力均随浓度的增加而增大。

(2)植物甾醇清除O2－·的IC50为0.07mg/mL，BHT为0.09mg/mL，VE为0.13mg/mL，清除O2－·能力均随浓度的增加而增大。

(3)植物甾醇清除DPPH·的IC50为0.80mg/mL，BHT为0.50mg/mL，VE为0.60mg/mL，清除DPPH·能力均随浓度的增加而增大。

参考文献

[1]胡伟楠,薛雨婷,王小磊等.食用油的存储研究进展.当代化工研究2022-07-08

[2]SNT 2360.5-2009《进出口食品添加剂检验规程第5部分：抗氧化剂》

[3]刘杨,申孟,杨宏苗.食品中抗氧化剂检测技术的研究进展.粮食与油脂,2020-03-10

[4]方允中,郑荣梁.自由基生物学的理论与应用.科学出版社,2008:21-45.

[5]王晓莹.天然抗氧化剂抗氧化活性的测定及应用.西安:西北大学,2007.

[6]郭雪峰,岳永德,孟志芬等.用清除羟自由基法评价竹叶提取物抗氧化能力.光谱学与光谱分析,2010,30(2):508-511.

[7]展跃平,张焕新.橘渣中类黄酮物质提取及抗氧化活性.江苏农业科学,2010(6):471-473.

[8]金鸣, 蔡亚欣, 赵辉. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟基自由基生物化学与生物物理进展. 1996, 23(6): 536-553.