东莞市东江检测有限公司
摘要:目前污泥中粪大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法,这两种方法均是根据总大肠菌群具有的生物特性,经过初发酵、平板分离、革兰氏染色镜检、复发酵的过程检测污泥中粪大肠菌群的数量。传统方法检测前须准备大量培养基,检测耗时长,有诸多缺点。现希望通过将固定酶底物法应用于污泥中粪大肠菌群的检测,缩短检测时间,节省人力成本,提高检测效率和检测的准确率。
关键词:污泥粪大肠菌群 滤膜法 固定酶底物法
随着科学技术的发展,城镇化进程的加快,城镇生活污水总量逐年提高,从而导致产生的大量的污泥[1]。粪大肠菌群是城镇污水处理厂污泥泥质控制的一项重要指标[2]。粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示样品中有否有粪便污染。粪大肠菌群数量的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。在CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中城市污泥粪大肠菌群的检验采用滤膜法测得[3]。该方法使用新滤膜前需对滤膜进行鉴定,同时对滤膜上形成的不典型或疑难的菌落须进行涂片、革兰氏染色和镜检,另一部分接种于EC培养基看是否产气。由此可见,滤膜法检测污泥粪大肠菌群非常繁琐,需要较长的时间获得准确的检测结果。随着酶底物技术的发展,固定底物酶底物法越来越多地应用于检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、耐热(粪)大肠菌群,是GB/T5750.12-2006的国标方法[4]。污泥粪大肠菌群的检测同样是通过无菌水逐级稀释检测。因此,希望通过运用固定底物酶底物法检测污泥粪大肠菌群,以便更快捷的方式获得准确的检测结果。
1 材料与方法
1.1材料
培养基:M-TEC培养基、EC培养基、酶底物试剂(含97孔定量盘)
仪器:恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、程控定量封口机、干热灭菌箱、振荡器、滤膜过滤装置
其他:75mm平皿、接种环、革兰氏染色试剂盒、移液枪、试管、无菌瓶、无菌水、滤膜(孔径为0.45μm)、1L烧杯、火焰枪
1.2样品采集和制备
1.2.1取样方法
采用多点取样混合,样品质量不小于1kg。
1.2.2样品制备
用消毒过的小刀或者不锈钢药勺从样品中多点取样,研磨粉碎后,称取约1g样品,精确至0.0001g,备用。
1.3实验方法
1.3.1 CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中滤膜法
1.3.1.1滤膜灭菌
将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,煮沸灭菌3次,每次15min。前两次煮沸后换水洗涤2次以去除膜内残留溶剂。
1.3.1.2过滤
将样品倒入灭菌试管中,按1:10的倍数稀释,然后进行抽滤。用无菌镊子夹取滤膜放置于不锈钢滤头上,于滤杯内先加入约10ml无菌水,然后取1ml稀释好的待测样品,混合后抽滤。抽滤后再用少量无菌水冲洗滤杯内壁。抽完水样后继续抽气约5-10s,停止抽气,取下滤杯。用无菌镊子夹取滤膜边缘,置于M-TEC培养基上,滤膜截留菌面朝上,滤膜与培养基之间应无气泡,将平皿倒置,置于44.5℃恒温箱内培养24h。
1.3.1.3观察结果及验证
在M-TEC培养基上,粪大肠菌群菌落呈黄色。计数此类菌落数目。根据过滤水样量及滤膜上菌落数,乘上稀释倍数,即为每克污泥中粪大肠菌群数。对于不典型或难以辨认的菌落,应取一部分进行革兰氏染色镜检。另一部分接种于EC培养基中,经44.5℃培养24h后观察是否产气。产气则为有粪大肠菌群。
1.3.2 固定酶底物法
1.3.2.1 制样铺板
将样品倒入灭菌试管中,按1:10的倍数稀释。取1ml样品加入预装灭菌的100ml无菌瓶内,加入一支酶底物试剂,摇匀溶解后,倒入97孔板中,用定量封口机封口。将封好口的97孔板放置于44.5℃,培养24h。
1.3.2.2观察结果
观察97孔板中颜色的变化,颜色比97孔阳性比色盘相同或者颜色更深则为阳性,反之则为阴性。计算大孔和小孔的阳性孔数,查对应的MPN表得到查表数,乘回相应的稀释倍数得到定量的检测结果。如果结果不容易判断,可以继续培养4h。
1.4 微生物检测结果为偏态分布,按统计分析要求,其检测结果应以10为底的对数转换后进行分析。
2 实验结果与分析
2.1精密度实验
某污水厂污泥样品分别用滤膜法和固定酶底物法进行6次重复测定,结果见表1。
表1 精密度实验结果
平行样 | 滤膜法(个/g) | 酶底物法(MPN/g) |
1 | 24000 | 37300 |
2 | 44000 | 33500 |
3 | 29000 | 25900 |
4 | 15000 | 40800 |
5 | 22000 | 34500 |
6 | 27000 | 46700 |
平均值(x ) | 26833.33 | 38083.33 |
标准偏差(S) | 0.15 | 0.09 |
相对标准偏差(RDS%) | 3.48 | 1.91 |
注:标准偏差(S)和相对标准偏差(RDS%)为原始数据以10为底数的对数转换后所得。
由上表可见,固定酶底物法测得结果的精密度要优于滤膜法。固定酶底物法结果是由查表得出,是以最大可能数来表示的,它是基于泊松分布的一种间接计数方法。表中相同样品,用不同方法得出结果差异较大,是因为酶底物法灵敏度更高,处于休眠状态或者活性低的细菌同样能够被培养。同时,固定酶底物法测得结果不需要再验证,该方法操作简便,准确度高,无环境要求限制,只需要相对干净的环境即可开展实验,无需在洁净室内操作。
2.2结果一致性实验
2.2.1选取同一个污泥样品用两种方法分别检测30次后统计分析,比对两种方法测得的粪大肠菌群结果(见表2)。
表2 实际样品滤膜法和酶底物法比对结果
检测样品 | 检测方法 | 检测结果(个/g或MPN/g) | 均值 x 个/g或MPN/g | 方法结果偏差η% | 测定次数n | 标准偏差S | 统计量 F | t检验法t | ||||
污泥 | 滤膜法 | 27000 | 26000 | 33000 | 39000 | 22000 | 32733 | 9.9 | 30 | 7343.5 | 1.490 | 1.970 |
33000 | 32000 | 33000 | 40000 | 40000 | ||||||||
32000 | 22000 | 40000 | 26000 | 27000 | ||||||||
26000 | 33000 | 38000 | 27000 | 49000 | ||||||||
42000 | 27000 | 33000 | 22000 | 33000 | ||||||||
27000 | 43000 | 26000 | 39000 | 45000 | ||||||||
酶底物法 | 33600 | 33600 | 40400 | 27500 | 33600 | 36147 | 30 | 6009.7 | ||||
36400 | 45200 | 33000 | 38800 | 27200 | ||||||||
45700 | 33100 | 33600 | 26900 | 26500 | ||||||||
31700 | 34500 | 39300 | 45000 | 39300 | ||||||||
31300 | 37300 | 45000 | 38900 | 39300 | ||||||||
39300 | 34100 | 27200 | 47100 | 40000 |
如表2所示,滤膜法和酶底物法30次检验结果统计,统计量F为1.34,小于1.86;t检验法t为1.980,小于2.002。因此,两种方法不存在显著性差异。
2.2.2质控样分析
分别用滤膜法和固定酶底物法对有证标准物质进行检测,同时做平行检测,检测结果见表3。
表3 有证标准物质检测结果
检测方法 | 检测结果(CFU或MPN/100mL) | 平均值 (CFU或MPN/100mL) | 可接受范围 (CFU或MPN/100mL) | |
平行样1 | 平行样2 | |||
滤膜法 | 204 | 178 | 191 | 18-659 |
酶底物法 | 254 | 282 | 268 | 20-768 |
如上表所示,滤膜法和固定酶底物法检测有证标准物质的结果不完全一致,但均在可接受范围内,说明两种方法均有一定的准确性。
3结论
经过实验表明,滤膜法和酶底物法检测污泥中粪大肠菌群不存在显著性差异,酶底物法精密度优于滤膜法,有更好的重现性。而且实验方法简便,不需要平板分离和染色镜检的过程,缩短了实验的时间,简便易于操作。因此,可以用固定酶底物法替代滤膜法检测污泥中粪大肠菌群。
参考文献
[1]卢彦丞.城镇污水厂污泥处置现状及可持续发展对策[J].资源节约与环保,2021,1.
[2]应立春.污泥中粪大肠菌群菌值检测方法的改进[J].广州化工,2014,42(6).
[3]中华人民共和国建设部.CJ/T221-2005,城市污水处理厂污泥检验方法[S].1版,北京:中国标准出版社,2006.
[4]中华人民共和国卫生部.GB/T5750.12-2006,生活饮用水标准检验方法微生物指标[S].1版,北京:中国标准出版社,2007.