维生素C注射液（5ml:1g）无菌检查方法适用性确认

维生素C注射液（5ml:1g）无菌检查方法适用性确认

揭亚芹

                   云南白药集团股份有限公司， 云南昆明650500

摘要  目的：药品无菌检查中，污染的微生物的种类和抗性、样品的处理方法、样品的浓度、检查方法、培养基、培养条件等，将直接影响检查结果。只有在各检查条件均适宜时，才能保证样品中污染的微生物的充分生长。因此无菌检查应证明所采用的方法和检验条件是可靠的，以保证检查方法的完整性和实验结果的可靠性。 方法：试验按《中国药典》2020年版四部通则1101无菌检查法要求，用HTY-2000AG8无菌检查用隔离器，采用薄膜过滤法，加入6种株菌：大肠埃希菌（ Escherichia coli）〔CMCC(B)44 102〕,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus ）[CMCC(B)26 003]  ，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）[CMCC(B)63 501] ，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941]，白色念珠菌(Candidaalbicans) [CMCC(F)98 001] ，黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC(F)98 003] 。对每一试验菌在含供试品的容器中的生长情况逐一进行确认，从而建立该品种的无菌检查方法。结果：与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好。关键词：方法适用性试验；薄膜过滤法

1 实验材料

1.1样品  维生素C注射液3批，批号为：ZKA2003、ZLA2006、ZLA2009，规格均为：5ml:1g。

1.2培养基  胰酪大豆胨液体培养基（批号200305）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号200826）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号190213）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号200309）、硫乙醇酸盐流体培养基（批号1909182）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号190902）、0.1％蛋白胨水溶液（批号190530）均来源于北京三药科技开发公司。

1.3 仪器  脉动真空灭菌柜 MQS0.6（脉动真空灭菌柜 MQS0.6 ），脉动真空灭菌柜 山东新华医疗器械股份有限公司），pH计S220-K（梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司），生物安全柜（江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），移液器（芬兰百得实验仪器（中国）有限公司）。

1.4试验菌种  大肠埃希菌（ Escherichia coli）〔CMCC(B)44 102〕,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus ）[CMCC(B)26 003]  ，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）[CMCC(B)63 501] ，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941]，白色念珠菌(Candidaalbicans) [CMCC(F)98 001] ，黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC(F)98 003] 均来源于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1  菌液制备  接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml 含菌数不大于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上接种黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05％（ml / ml）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml / ml）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml 含孢子数不大于100cfu 的孢子悬液。

2.2  接种菌量测定  分别接种（可采用涂布法或倾注法）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液至胰酪大豆胨琼脂培养基，置30～35℃培养不超过3天（生孢梭菌厌氧培养），计数；分别接种（可采用涂布法或倾注法）白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，置20～25℃培养不超过5天，计数。每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定菌数。

2.3  方法适用性试验（薄膜过滤法）

2.3.1  试验管  取供试品60支，以无菌操作开启后，用三联全封闭式薄膜过滤器直接过滤，再用100ml 0.1％蛋白胨水溶液冲洗薄膜过滤器管路，冲洗后每个滤筒中分别加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，再分别加入不大于100cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌。另取供试品60支，以无菌操作开启后，用三联全封闭式薄膜过滤器直接过滤，再用100ml 0.1％蛋白胨水溶液冲洗薄膜过滤器管路，冲洗后每个滤筒中加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，再分别加入不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌。

2.3.2 对照管 取3份100ml的硫乙醇酸盐流体培养基加入三联全封闭式薄膜过滤器相应滤筒内，分别加入不大于100cfu的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌；另取3份100ml的胰酪大豆胨液体培养基加入三联全封闭式薄膜过滤器相应滤筒内，分别加入不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌。

2.3.3  阴性对照管  取100ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液加入薄膜过滤器两个滤筒内过滤，过滤后将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及100ml胰酪大豆胨液体培养基分别加入相应滤筒内作为阴性对照。

上述加入硫乙醇酸盐流体培养基的容器置30～35℃培养，加入胰酪大豆胨液体培养基的容器置20～25℃，培养时间不超过5天。

2.3.4 试验结果   与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好。

表1  维生素C注射液ZKA2003、ZLA2006、ZLA2009方法适用性试验结果

试验菌株   第1天       第2天       第3天       第4天       第5天

大肠埃希菌（试验管）+       ++      ++      /        /

大肠埃希菌（对照管）+       ++      ++      /        /

金黄色葡萄球菌（试验管）+       ++      ++      /        /

金黄色葡萄球菌（对照管）+       ++      ++      /        /

生孢梭菌（试验管）+       ++      ++      /        /

生孢梭菌（对照管）+       ++      ++      /        /

白色念珠菌（试验管）-+       +      ++       ++

白色念珠菌（对照管）-+       +      ++       ++

黑曲霉（试验管）-+       +      ++       ++

黑曲霉（对照管）-+       +      ++       ++

枯草芽孢杆菌（试验管）-+       ++      ++       /

枯草芽孢杆菌（对照管）-+       ++      ++       /

阴性对照-----

注：培养天数及结果观察（ +  表示有菌生长，  ++ 表示生长良好 ，  —  表示无菌生长）

3 讨论

从表1可以看出：与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好。结论：维生素C注射液（5ml:1g）采用HTY-2000AG8无菌检查用隔离器，取规定量用薄膜过滤法检查，在该检验量、检验方法、检验条件下，对微生物无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，能保证所污染的微生物能充分检出。

参考文献

《中国药典》----2020年版