从拟雄激素效应探讨鬼针草提取物治疗干眼症实验机制

 从拟雄激素效应探讨鬼针草提取物治疗干眼症实验机制

钟世荣1，陈铃2，吴映霖3*

1.江西省人民医院康复医学科，江西 南昌330006；2.南昌市第八医院中医全科，江西 南昌330008；3.南昌大学第一附属医院麻醉科，江西 南昌330006

【摘要】 目的 研究鬼针草提取物对雄兔去势所致干眼症的体外实验机制。方法 选取新西兰白兔60只(60眼，均为右眼) ，分为6组，制作去势雄兔干眼症模型，检测各组K19、UC16、NF-κB、PGE2等因子表达变化。结果：与A组、B组比较，各组K19、UC16、NF-κB、PGE2等因子表达变化蛋白表达差异均具有显著性(均P< 0.01)。结论：鬼针草提取物治疗干眼症可能与增加MUC5AC、VEGF的表达，减低K10、K19、UC16、NF-κB、P53、MAPK、JAK-STAT TNF-α、COX-2及PGE2的表达有关。

关键词; 鬼针草提取物; 干眼症; 拟雄激素效应

基金项目：江西省中医药科研课题（编号：2019A107）

作者简介：钟世荣（1983-10），男，汉族，硕士，主治医师，研究方向：中医康复和中药药理，E-mail ：262489826@qq.com。通讯作者*吴映霖(1993-09)，女，汉族，主管护师，研究方向：麻醉、中医护理和中药药理，E-mail ：932203756@qq.com

干眼症据流行病学统计发病率高，雄激素水平下降为其主要发病原因，我们以鬼针草提取物滴眼液分别对体外干眼模型，验证其作用机理。

1材料与方法

1．1．鬼针草有效部位的提取和鬼针草提取物滴眼剂的制备

参考文献的方法[1]制定鬼针草有效部位的提取方案制备鬼针草鬼针草提取物，制备鬼针草提取物滴眼剂。

1．2．兔结膜组织块培养

参考文献[1]的方法进行兔结膜组织块培养。

2. 实验方案：

2.1．实验分组及检测指标：

利用以上结膜组织块体外培养模型（空气暴露法），使用不同梯度浓度的鬼针草提取液滴眼，根据加入物质的不同，分为6组（空白对照组（A组），PBS组（B组），最佳浓度鬼针草提取液组（C组），最佳浓度鬼针草提取液+雄激素受体抗体组（D组），最佳浓度鬼针草提取液+雌激素受体抗体组（E组），最佳浓度鬼针草提取液+雄激素受体抗体组+雌激素受体抗体组（F组），每组15只。观察14天，通过裂隙灯观察结膜炎症指数。

2.2. 制备冰冻切片、HE染色

结膜组织块标本在不同时间点用OCT包埋制备冰冻切片，HE染色。组织切片用4%多聚甲醛固定，光镜下观察照相。

2.3. 免疫组织化学染色法检测各组MUC5AC、K10、K19、UC16蛋白的表达

2.4. ELISA法测定NF-κB、P53、MAPK及JAK-STAT蛋白的表达

2.5.  Western blot检测TNF-α、VEGF、COX-2、PGE2等因子表达变化

3.  统计学分析

所有资料均采用SPSS16.0统计学软件进行处理，计数资料用X2检验，计量资料用t检验。

4 结果

4.1各组病理结果

A组、B组:泪腺结构完整，腺小叶清晰，腺体胞浆丰富，细胞内物质较多，腺体间质偶见淋巴细胞浸润，腺体结构清楚，未见腺体萎缩、间质水肿等改变。C组、 D组:腺体间质散在浆细胞浸润，泪腺上皮细胞萎缩，内柱状上皮细胞萎缩，腺细胞内物质减少。E组:泪腺组织结构完整，腺上皮结构清晰，腺小叶中腺泡内物质大量排空，未见明显腺体萎缩。F组:泪腺结构尚完整，腺上皮结构欠清晰，腺体间质少量浆细胞浸润，泪腺上皮细胞轻度萎缩，内柱状上皮细胞轻度萎缩。

4．2免疫组织化学染色法检测各组MUC5AC、K10、K19、UC16蛋白的表达

由表1可见：与A组、B组比较，各组MUC5AC蛋白表达均显著增加，差异均具有显著性(均P< 0.01)；与B组比较，K10、K19、UC16蛋白表达显著减低(均P< 0.01)，MUC5AC显著增加；与C组、D组比较，E组、F组K10、K19、UC16蛋白表达均显著减低，MUC5AC显著增加,差异均具有显著性〔P< 0.01)；与E组比较，F组间无显著差异（均P＞0.05）。

表1   各组MUC5AC、K10、K19、UC16蛋白表达比较 （%，±S）

注：与A组、B组比较△P＜0.01；与B比较，▲P＜0.01；与C组、D组比较★P＜0.01，与E组比较，※P＞0.05

4．3  各组血清ELISA法测定NF-κB、P53、MAPK及JAK-STAT的变化　

由表2可见：与B组比较，C组、D组、E组、F组NF-κB、P53、MAPK及JAK-STAT蛋白表达均显著减低，差异均具有显著性(均P< 0.01)；与C组、D组比较，E组、F组NF-κB、P53、MAPK及JAK-STAT蛋白表达均显著减低，差异均具有显著性〔P< 0.01)；与E组比较，F组间无显著差异（均P＞0.05）。

表2   各组NF-κB、P53、MAPK及JAK-STAT的表达比较(±S)

注：与B组比较△P＜0.01；与C组、D组比较，▲P＜0.01；与E组比较，※P＞0.05

4．4  Western blot检测血清中的各种炎症因子TNF-α、VEGF、COX-2、PGE2等因子表达变化

由表3可见：与A组、B组比较，各组TNF-α、COX-2及PGE2蛋白表达均显著增加，差异均具有显著性(均P< 0.01)；与C组、E组、F组比较，D组TNF-α、COX-2及PGE2蛋白表达均显著减低，VEGF显著增加,差异均具有显著性〔P< 0.01)；E组、F组间无显著差异（均P＞0.05）。

表3   各组TNF-α、VEGF、COX-2、PGE2的表达比较(±S)

注：与A组、B组比较△P＜0.01；与B比较，▲P＜0.01；与C组、D组比较★P＜0.01，与E组比较，※P＞0.05

3. 讨论

干眼症是指由于泪液的量或质的异常引起泪膜不稳定和眼表损害而导致的一组眼不适症状[2]。雄激素水平下降引起的干眼症已渐成研究热点 [3] 。

本实验鬼针草提取物治疗干眼症可能与增加MUC5AC、VEGF的表达，减低K10、K19、UC16、NF-κB、P53、MAPK、JAK-STAT TNF-α、COX-2及PGE2的表达有关由此我们推测鬼针草提取物因其有高含量的黄酮类物质，所以能间接或可能直接产生拟雄激素活性作用，可以治疗雄激素水平下降引起的干眼症。其机理可能与增加MUC5AC、VEGF的表达，减低K10、K19、UC16、NF-κB、P53、MAPK、JAK-STAT TNF-α、COX-2及PGE2的表达，发挥拟雄激素效应，稳定体内雄激素水平，从而改善泪腺、睑板腺的分泌情况，减轻眼部组织的自身免疫反应，抑制泪腺和角膜的局部细胞凋亡，最终达到治疗雄激素水平下降所致干眼症有关。

  参考文献

1. 王玲，崔东安，周绪正，等.鬼针草的化学成分与药理作用 [J].现代药物与临床，2009，24(3)：147-150.
2. 蒋鹏飞，彭俊，周亚莎，等． 中医药治疗干眼疗效的 Meta 分析［J］． 国际眼科杂志，2018，18( 6) : 1023 － 1027．
3. 欧阳云，彭俊，彭清华，等． 密蒙花颗粒剂对去势雄兔泪腺细胞凋亡因子 Bax，Bcl － 2，Fas 和Fasl 的影响［J］． 中国中西医结合杂志，2017，37( 7) : 858 － 862．