二代测序技术在感染性疾病诊断的进展

二代测序技术在感染性疾病诊断的进展

             ,吴斯磊

温州市人民医院  浙江温州325006

摘要：感染性疾病是人类发病及死亡的主要原因之一。目前全球流行的新冠疫情就是感染性疾病中的一种，其给人类带来的死亡及直接或间接经济损害有目共睹。病原学的快速精准判断对感染性疾病的治疗起到关键性作用。然而传统病原学检测技术却有着诸如病原检测单一、精确度低、检测周期长、病毒及特殊病原体难以得到阳性结果等局限，因而导致临床治疗中常常出现在延误治疗时机或者抗菌药物滥用等情况。二代测序技术（Next-generation sequencing,NGS）以其高通量、覆盖度广、精确度高等优势，通过对样本所含基因进行测序，进一步明确细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体，为临床出现的新发、多重及疑难感染性疾病的确诊提供帮助。本文通过综述NGS的基本原理、临床应用，认识其现阶段存在的优缺点，使广大医疗工作者对NGS这一种新型的感染性疾病诊断工具有一定了解。

关键词：二代测序技术，感染性疾病，病原体。

１、ＮＧＳ技术简介

2005年Roche公司率先推出的基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件［1］。随着生命科学的发展，现有比较成熟的NGS平台主要包括Roche /454FLX、Illumina /Solexa Genome Analyzer和Applied BiosystemsSOLID system［2］。但根本原理依旧是将目标DNA或RNA片段碎片化，通过对碎片化后的基因组片段进行高通量的并行PCR、测序反应，通过获得大量测序数据，并与已知参考基因片段进行对比、定位和整合分析，经计算机生物信息分析技术分析从而获得完整的DNA 序列信息［3］。

2、NGS的临床应用

感染性疾病是每个临床医师都会遇到的问题，而感染性疾病也时时刻刻威胁着人类的健康。如何快速准确地明确病原体并指导抗生素的使用是临床工作永恒的话题。随着生命科学的发展，目前NGS的检测谱得到了充分的发展。

2.1 NGS在中枢神经系统感染的应用

中枢神经系统感染是神经科常见疾病之一，目前的确诊依据主要是通过从脑实质或脑脊液内检测到病原体。但受样品采集、检验技术、培养周期长等问题，临床上常出现经验性用药、诊断不明等情况，而目前脑脊液细菌培养阳性率约5.4%～24.3%，且部分病原体无法通过常规培养检出。2021年，西安交通大学附属医院刘京杭等报道了1例中枢系统感染动物溃疡伯杰氏患者的治疗及预后[4]。2020年郑州大学人民医院金珂等回顾性分析了该院2018年1-6月3例疑诊为中枢神经系统布鲁菌感染的患者通过对常规脑脊液、影像学检测及NGS检测进行对比，提示脑脊液NGS能够辅助中枢神经系统布鲁菌感染的临床诊断[5]。2018年北京协和医院神经科关鸿志教授主持开展了对病原体不明的疑似感染性脑炎者行脑脊液 NGS检测，结果检出了2例伪狂犬病毒感染患者( pseudorabies virus ，PＲV )［6］。

2.2 NGS在呼吸系统感染的应用

目前全球大流行的新冠疫情就是一种主要肺部感染为主要临床症状的公共卫生事件。针对呼吸系统感染的特点，临床实践已对包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液在内的多种呼吸道标本进行NGS检测，检测结果提示了NGS具有良好的诊断性能。随着免疫抑制剂及糖皮质激素的使用、恶性肿瘤及艾滋病患者的增多，临床上遇到免疫功能低下并发感染的患者越来越多。其中卡式肺孢子菌肺炎因其传统培养难以获取，故临床诊断多依赖于对卡式肺孢子菌进行染色方法、在显微镜下的观察。但这种方法容易受主观经验、标本留取制备等因素影响，故临床上对卡氏肺孢子菌肺炎检出存在一定困难。2019年Zhang Y团队研究表明NGS技术对于耶氏肺孢子虫的敏感性高于传统的显微镜检和吉姆萨染色[7]。2018年MIAO Q等学者提出，NGS诊断病原体的敏感度和特异度分别为50.7%和85.7％。针对结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌和真菌等病原体，NGS要优于传统的培养。此外，与传统培养相比，对使用了抗生素后留取的标本，NGS的阳性检出率较高[8]。

2.3 NGS在血流感染性疾病中的应用

目前，诊断血流感染的金标准是血培养。但培养时间较长、经验性抗生素使用后的假阴性等问题时常困扰临床医师。NGS凭借其快速检测血液中所含病原体基因为临床诊断提供了帮助。2020年黄宇收集了承德医学院附属医院血液科疑似血流感染的血液病患者50例，通过对比基因测序和血培养的检测结果，发现血培养阳性率为60.0%，而NGS阳性率为78.0%，差异有统计学意义（P＝0.049，P＜0.05）。此外，其提出通过对比治疗前后病原体基因含量来判断治疗效果的观点为抗生素的停用起到了一定的指导作用[9]。另外，《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》[10]就血流感染患者也有提出相关观点：疑似血流感染的患者若其血培养3ｄ未报高阳性结果且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存的血标本进行NGS检测。在国外，NGS的应用也得到了充分的肯定。2016年Nature Reviews Genetics发表一篇系统性综述，充分介绍了NGS在血液感染患者中的应用[11]；

3. NGS技术的局限性

作为一种新技术，NGS虽然为临床诊断提供了一定的帮助，但仍存在一定的局限性。

3.1背景噪音

NGS的根本原理是通过对标本内基因片段的分析来协助诊断病原体。但人体自身的基因组远远多余病原体的基因组.国外的研究表明，检测等量的人类和细菌细胞混合后所产生的标本发现中99.9%的为人类DNA，这将严重影响NGS的灵敏度及效率。因此，消除宿主背景噪音是首要解决的问题。2016年，Hasan等发现经0.025%的非离子表面活性剂皂甙处理后，标本内微生物与人基因组读数的比率增加了20-650倍[12]。

3.2假阴性结果

虽然NGS以其高通量、覆盖度广、精确度高著称，但临床上仍有可能假阴性结果。可能存在以下原因：1.病原体数据库不完整，NGS所获得数据需通过与数据库对比来确定病原体。虽然现有的病原体数据库已经十分丰富了，但随着时间的发展，必然会出现各种罕见病原体感染病例，这需要我们不断扩充病原体的基因组数据库。2.样本中病原体载量：诸如结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌主要是寄居在细胞内，单纯的体液样本中所含病原体遗传物质载量较少，故假阴性可能高。

3.3假阳性结果

NGS的敏感性极高，可以检出样本中的多种病原体。但人体本身就存在多种共生菌、定植菌，且随着社会老龄化，慢性病、老年病患者日益增多，定植菌现象日益严重。而NGS虽然能检测病原体，但无法判断为定植菌还是致病菌，故仍需综合症状、体征、流行病学及实验室检测、影像学检测等传统检查，进一步验证NGS结果，降低假阳性率。另外，任何的标本污染都可能影响样本结果的判读。故在标本的采集、储存、运输、检验等各个环节都需制定相应的操作规范，以降低外源性核酸污染风险。

3.4耐药菌

2019年，WHO在瑞士日内瓦举行新闻发布会，并发布了全球114个国家抗菌药物耐药及抗生素耐药的监测报告数据。监测报告数据显示耐药菌的形势仍然严峻。NGS可以检测病原体是否携带耐药基因组，这为耐药菌的鉴定提供了思路。2019年，Yan等研究发现：对mecA-介导的耐甲氧西林的葡萄球菌，NGS检测灵敏度为77.4%，检测特异性为100%[13]。然而NGS也存在诸多不足：1.耐药基因数据库的范围需要进一步扩增。2.检测和分析流程尚未标准化。3.检测成本高。4.对实验操作人员和数据分析人员要求高。5.耐药基因的命名规则尚未统一等。

小结

NGS技术是通过直接检测样本内的病原体基因片段，与已知参考基因片段进行对比、定位和整合分析，从而确定样本内的致病菌。作为一种发展迅速的新技术，NGS可以快速、灵敏地检测出样本内是否含有细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体。这为疑难、罕见病原体感染的确诊提供了帮助，为个体化用药提供了依据。然而NGS仍存在诸如假阳性及假阴性率、微生物数据库不完整、缺乏对耐药菌的研究等问题，目前只能作为传统微生物检测技术的一个重要补充方法。尽管如此，NGS的潜力仍十分巨大。相信随着技术的不断发展以及更多的循证医学证据出现，NGS必将成为感染性疾病诊治中起到越来越重要的作用。

参考文献

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