中药角药对人胃癌SGC7901细胞侵袭转移影响的实验研究

中药角药对人胃癌SGC7901细胞侵袭转移影响的实验研究

杨攀[1],冯飞雪1,江静1,吴易超1,侯俊明1*

摘要：

目的：探讨不同剂量中药角药对人胃癌SGC7901细胞侵袭转移的影响。

方法：动物实验：50只大鼠分为空白组、5-Fu组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，分别给予生理盐水灌胃、氟尿嘧啶腹腔注射、中药角药16.2g/Kg灌胃、中药角药8.4g/Kg灌胃、中药角药4.2g/Kg灌胃，处理时间为1周，后处死大鼠，制备含药血清。

细胞实验：选用人胃癌SGC7901细胞，进行常规复苏、传代、培养，用各组大鼠含药血清干预细胞，待细胞处于对数生长期时进行划痕实验，于0小时48小时拍照，Image J计算细胞迁移率；进行Transwell侵袭实验，于24小时时进行拍照，计算穿膜细胞数；提取细胞总RNA，行RT-PCR实验检测HIF-1α、uPA、uPAR 基因的表达；提取细胞总蛋白，进行Western Blot实验检测HIF-1α、uPA、uPAR 蛋白表达。

结果：1.划痕实验：与空白组比较，高剂量组可有效降低48小时细胞迁移率（P＜0.05），抑制人胃癌SGC7901细胞的侵袭转移，并且与5-Fu组抑制胃癌侵袭及转移疗效相当（P＞0.05）；与高剂量组比较，中、低剂量组细胞迁移率较高（P＜0.05）；2.Transwell侵袭实验结果显示：与空白组比较，中药角药可有效减少24小时穿膜细胞数，抑制人胃癌SGC7901细胞的侵袭转移（P＜0.05）；与5-Fu组比较，中药角药组穿膜细胞数多（P＜0.05）；与高剂量组比较，中、低剂量组细胞穿膜细胞数多（P＜0.05）；3.RT-PCR实验结果显示：与空白组比较，角药高、中剂量可以有效减少人胃癌SGC7901细胞HIF-1α、uPA、uPAR mRNA的表达（P＜0.05）；与5-Fu组比较，角药各组以上基因表达量较高（P＜0.05）；与高剂量组相比，中、低剂量上以上基因表达明显升高（P＜0.05）；4.Western Blot实验结果显示：与空白组比较，中药角药可有效减少人胃癌SGC7901细胞HIF-1α、uPA、uPAR蛋白的表达（P＜0.05）；与5-Fu组比较，角药组蛋白表达量较高（P＜0.05）；与高剂量组相比，中、低剂量上以上蛋白表达明显升高（P＜0.05）。

结论：中药角药能够抑制人胃癌SGC7901细胞侵袭转移，可下调HIF-1α、uPA、uPAR 基因和蛋白的表达；且其抑制作用随浓度的升高而增强，具有浓度依赖性。

关键词：胃癌；角药；SGC7901；侵袭；转移；HIF-1α；uPA/uPAR

前言

胃癌（Gastric Cancer，GC）指起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，2020年全球癌症报告指出，中国胃癌发病率及死亡率位居第3位[1]，约有48万胃癌新发病患者及37万死亡患者。近年来，手术为主的化疗、靶向及免疫治疗的综合治疗模式的应用，使得胃癌患者生存率明显提高[2]，但转移仍是导致患者死亡的主要原因，如何抑制或是减少GC的转移是提高治愈率、降低死亡率的关建。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达可促进肿瘤细胞的增殖、入侵及转移[3,4]；尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)及其受体(urokinase-type plasminogen activator recepto，uPAR)的表达与胃癌患者发生腹膜转移呈正相关[5]，与临床TNM分期、浸润的程度呈正相关[6]。是评价肿瘤侵袭与转移的能力的重要指标。

中医药治疗在胃癌预防、治疗及术后功能恢复等方面效果显著，可提高患者生存质量，减少化疗药物副作用、增加药效，提高胃癌患者机体免疫力的功能[7]，有其独特优势。导师侯俊明教授30余年治疗胃癌临床实践中发现，在辨证论治的基础之上，加入现代医学证明具有清热解毒、抗肿瘤作用的角药[8-10]（半枝莲、白花蛇舌草、山慈菇），可增加临床疗效。本实验研究中药角药对肿瘤细胞侵袭转移的影响，已达到为临床应用提供现代学依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 SPF健康级SD大鼠，人胃癌SGC7901细胞，半枝莲、白花蛇舌草、山慈菇各15g，氟尿嘧啶注射液，RPMI-1640培养基，Transwell小室、Matrigel基质胶，高效RIPA细胞裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，HIF-1α抗体，uPA抗体、uPAR抗体购。

1.2 实验方法：

1.2.1 动物实验：将50只SD大鼠随机分成角药高剂量组、角药中剂量组、角药低剂量组、氟尿嘧啶组及空白组，分别给予角药16.2g/Kg、角药8.4g/Kg、角药4.2g/Kg灌胃、氟尿嘧啶腹腔0.0025g/Kg注射及生理盐水腹腔注射，干预时间为1周，后处死大鼠，腹主动脉抽取血液，离心得到含药血清，留取备用。

1.2.2 细胞实验 将人胃癌SGC7901细胞培养于含胎牛血清及双抗的完全培养基中，环境温度为37℃，含有5%CO2，于每周末进行消毒。每2天换液1次，长满瓶底约80%左右时传代或冻存。

1.2.3 细胞划痕实验 将不同组含药血清培养的SGC7901细胞接种于6孔板中，用无菌100ul枪头于培养基上均匀的画出四条直线，冲洗后加入无血清培养基，于0h、48h拍照，后用Image J 软件计算细胞迁移率。

1.2.4 Transwell实验 基质胶与RPMI-1640按照一定比例混匀，接种至上室底，将各组细胞200ul加入上室，于下室中加入含20%胎牛血清的培养液800ul，培养24h，PBS清洗上室，湿润棉签擦上室底，于4%甲醛中固定30min，台盼蓝染色30min，镜下观察并计数小室底的细胞数。

1.2.5 RT-PCR实验 培养含药血清培养的不同组的SGC7901细胞后提取总RNA，反转录成cDNA，将设计好的引物进行RT-PCR反应，Thermo Scientific PikoReal软件（Thermo公司）分析PCR过程各检测样本的CT(Threshold cycle)值，通过2-△△CT进行相对定量计算。

1.2.6 Western Blot实验 将经含药血清培养24h的各组细胞，用RIPA裂解液提取不同组细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度；进行样品实际浓度，将蛋白变性后-80℃保存；经过制胶、上样、电泳后转膜，进行封闭，一抗及二抗孵育，ECL试剂曝光显影，Image J软件分析显影的灰度值。

2 结果

2.1 动物一般情况 用氟尿嘧啶及中药角药腹腔注射及灌胃期间，发现5-Fu组大鼠一般状态较差，有腹泻情况发生，而中药角药各组大鼠无明显不适。

2.2 细胞划痕实验 结果表明：与空白组比较，5-Fu组及高剂量组细胞迁移率明显下降（P＜0.05），中及低剂量组细胞迁移率无明显变化（P＞0.05）；与5-Fu组比较，高剂量组细胞迁移率相当（P＞0.05），中剂量组及低剂量组较低（P＜0.05）；与高剂量组比较，中及低剂量组细胞迁移率较大（P＞0.05）。表明角药抑制SGC7901细胞迁移和其药物剂量相关，具有浓度依赖性。详见表1。

表1 划痕实验（48h）细胞迁移率（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，◆P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.3 Transwell侵袭实验 实验结果表明：与空白组比较，5-Fu组及角药各剂量组穿膜细胞数均减少（P＜0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组穿膜细胞数均高于5-Fu组（P＜0.05）；与高剂量组比较，中剂量及低剂量组穿膜细胞数均增加（P＜0.05）。表明角药对SGC7901细胞的抑制作用与浓度相关，具有浓度依赖性。详见表2。

表2 Transwell侵袭实验穿膜细胞数（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.4 RT-PCR实验

2.4.1 HIF-1α基因表达 与空白组比较，5-Fu组及角药各剂量组HIF-1α表达量均降低（P＜0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组HIF-1α表达量均升高（P＜0.05），说明在降低HIF-1α方面中药组效果差于5-Fu组；与高剂量组比较，中、低剂量组HIF-1α表达量升高（P＜0.05）。表明中药抑制 HIF-1α表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表3。

表3 各组细胞HIF-1α基因表达量（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.4.2 uPA基因表达 与空白组比较，5-Fu组及高、中剂量组uPA表达量均降低（P＜0.05），低剂量对uPA的降低不明显（P＞0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组uPA表达升高（P＞0.05），说明中药抑制uPA表达效果差于氟尿嘧啶。与高剂量组相比，中、低剂量组uPA表达升高（P＜0.05）。表明角药抑制 uPA表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表4。

表4 各组细胞uPA 基因表达量（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.4.3 uPAR基因表达 与空白组比较，5-Fu及角药各剂量组uPAR表达均降低（P＞0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组uPAR表达均升高（P＞0.05），说明角药抑制uPAR表达方面效果差于氟尿嘧啶效果；与高剂量组比较，中、低剂量组uPAR表达量升高（P＞0.05）。表明角药抑制 uPAR 表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表5。

表5 各组细胞uPAR 基因表达量（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.5 Western Blot实验

2.5.1 HIF-1α表达 与空白组比较，5-Fu组及高、中剂量组HIF-1α表达均降低（P＜0.05），低剂量组降低HIF-1α表达效果不佳（P＞0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组HIF-1α表达均升高（P＜0.05），说明角药抑制HIF-1α表达效果差于氟尿嘧啶；与高剂量组比较，中、低剂量组HIF-1α表达量升高（P＜0.05）。角药抑制 HIF-1α表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表6。

表6 各组细胞HIF-1α蛋白表达灰度值（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.5.2 uPA表达 与空白组比较，5-Fu组及高、中剂量组uPA减少（P＜0.05），低剂量组对uPA的减少不明显（P＞0.05）；与5-Fu组比较，角药各剂量组uPA表达均升高（P＜0.05），说明与氟尿嘧啶对比，角药效果差；与高剂量组比较，中、低剂量组uPA表达升高（P＜0.05）。角药抑制uPA表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表7。

表7 各组细胞uPA蛋白表达灰度值（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

2.5.3 uPAR表达 与空白组比较，5-Fu组及角药各剂量组uPAR表达均降低；与5-Fu组比较，角药各剂量组uPAR表达均升高；与高剂量组比较，中、低剂量组uPAR表达升高。角药抑制uPAR表达和其浓度相关，具有浓度依赖性。详见表8。

表8 各组细胞uPAR蛋白表达灰度值（x±s）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与5-Fu组比较，▲P＜0.05；与高剂量组比较，●P＜0.05。

讨论

肿瘤的侵袭和转移就是其重要的生物学特征之一，是导致患者死亡的一大因素[5]。“转移瀑布” 学说[11]、“种子-土壤”学说[12]及与机械和结构相关的转移学说来解释肿瘤细胞侵袭及转移这一复杂的过程；如何防止肿瘤细胞侵袭、转移是治疗肿瘤的关键。HIF-1α是一种转录因子，受到氧分压的变化而表达，不仅可以在乏氧时活化，也可在常氧状态下表达并发挥生物学意义。研究表明，在GC组织中， HIF-1α的表达与浸润深度、淋巴结转移情况、临床分期、血管生成呈正相关[13-15]，可以上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[16]、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)[17]，下调上皮型钙粘素(E-cadherin,E-cad)与β链接素(catenin,β-cat)使细胞与基质粘附性降低而利于侵袭转移[18]。uPA 可以水解纤溶酶原为纤溶酶，进而水解纤维蛋白原，是溶解 ECM 的重要步骤[19,20]，uPAR与uPA结合后提高细胞表面 uPA 前体（pro-uPA）的浓度、促进无活性的pro-uPA向uPA 转化，作用于细胞表面， 促进ECM的降解；uPAR 可激活 MMPs 系统[21]、 玻连蛋白(Virtorenctin,VN)及整合素(integrin)

[22]促进癌症的侵袭及转移。

周仲瑛教授[23,24]提出的“癌毒学说” 来解释肿瘤的发生发展，他认为肿瘤产生的最根本原因是“癌毒”，癌毒是在机体脏腑功能失调、阴阳失衡，受到来自自身体内及体外致病因子的诱导，产生的一类特定的产生恶性肿瘤的致病因子[25]，癌毒留结、走注、残留及伤正是肿瘤发生、侵袭转移、复发及恶化的根本原因，治疗以消癌、解毒、扶正祛邪为原则，常用具有清热解毒功效、具有抗肿瘤作用的中药治疗恶性肿瘤。三味药应用称之为“角药”，可以达到增强疗效或减少副作用的目的，针对疾病具体的病因、病机、治则治法以及药给物本身的四气五味而组合在一起使用的药物[26]。本实验所采用的角药为山慈菇-半枝莲-白花蛇舌草三味药的叠加组合，均具有清热解毒、抗肿瘤作用[27-29]，属于同类相须配伍，以达到治疗肿瘤的目的。

实验表明，角药高剂量组在抑制细胞迁移率、下调HIF-1α、uPAR、uPAR

基因及蛋白的表达水平有类似氟尿嘧啶的效果，但整体效果较5-Fu组稍差，其中角药中、低剂量组在整个实验过程中以上指标变化不显著；但其腹泻等胃肠道相关副作用较氟尿嘧啶组少，用药安全。究其原因，考虑与药物剂量过小、灭活血清中有效成分的丧失及长时间保存血清相关，在今后的实验中需增加更加细致的分组、增加实验次数等来得到更为准确的实验数据。

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【基金项目】陕西省中医药管理局中医药科研课题（课题编号 JCPT001）

【作者单位】1 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000

            * 陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000

【作者简介】杨攀（1993-） 男  住院医师 主要研究方向：消化道肿瘤的中西医结合基础与临床研究。

【通讯作者】侯俊明 男 主任医师 主要研究方向：消化道肿瘤的中西医结合基础与临床研究。