他克莫司软膏对银屑病患者Th17/Treg细胞免疫平衡的影响

他克莫司软膏对银屑病患者Th17/Treg细胞免疫平衡的影响

张庆伟 ,王艳慧(通讯作者）

1 新泰市皮肤病防治所；山东新泰 271219

  2  新泰市第二人民医院；山东新泰 271219

目的：探究在银屑病患者中使用他克莫司软膏治疗Th17/Treg免疫平衡的变化。

方法：选取2017年2月至2017年7月我院收治银屑病患者50例寻常型银屑病患者为观察组（n=50），对照组为同期于我院行健康查体的50例健康人群（n=50）。我们对观察组使用0.1%他克莫司软膏进行治疗（2次/d，疗程4周），对照组不使用药物。在治疗期间持续搜集银屑病患者的皮损组织，观察治疗期间银屑病患者治疗前、后的皮损组织中免疫指标Th17/Treg相关因子（RORγt、IL-17、 Foxp3和IL-10）的表达水平。结果：两组治疗前，观察组银屑病皮损组织中RORγt的表达阳性率显著高于对照组正常组织（P<0.05），Foxp3的表达阳性率显著低于对照组正常组织（P<0.05）；观察组外用0.1%他克莫司软膏治疗4周后RORγt的表达阳性率与治疗前相比明显下降（P<0.05），Foxp3的表达阳性率与治疗前相比有所上升（P<0.05）；观察组银屑病皮损组织中IL-17表达较对照组正常皮肤组织明显增高（P<0.05），IL-10的表达明显低于对照组正常组织（P<0.05）；经外用0.1%他克莫司软膏治疗4周后IL-17的表达明显降低（P<0.05），IL-10的表达与治疗前相比有所上升（P<0.05）。结论：在银屑病的发病过程中，患者局部皮损中Th17/Treg的免疫失衡发挥者重要作用，可以通过调节Th17/Treg免疫平衡影响银屑病的发展，检测Th17/Treg细胞变化可作为诊断银屑病的辅助指标以及他克莫司软膏治疗银屑病患者的疗效评价指标。

关键词：他克莫司  银屑病  Th17/Treg免疫平衡

银屑病（Psoriasis）是多因素相互作用引起的慢性鳞屑性皮肤病，病程迁延不愈且容易复发。2008年在中国六省市做了一项银屑病流行病学调查，结果显示患病率为0.47%。银屑病的发生对患者的身心健康、工作、日常生活都产生了不利的影响。银屑病的发病机制目前尚不明确，近年来，银屑病发病机制的研究结果显示[1-2]，Th17/Treg细胞的失衡在发病过程中可能发挥了一定作用，因为相较于正常健康人群，Th17细胞数量和分泌的细胞因子IL-17、IL-22在银屑病患者外周血中呈现较高表达水平，而Treg细胞和分泌的TGF-β、IL-10等细胞因子的表达呈现较低水平。在上个世纪80年代，日本学者Tsukuba分离得到一种具有较强免疫抑制作用的大环内酯类抗生素，称为他克莫司[3]。与用于治疗银屑病的免疫制剂环孢素相比，他克莫司具有更小的分子量和作为免疫制剂的免疫作用更强研究显示他克莫司能够抑制嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞释放炎性递质，降低T细胞的早期活化。此外，他克莫司能够上调转化生长因子(TGF-β)的表达。TGF-β的生成对Toll样受体(TLR)的表达进行了抑制，从而使得与银屑病发病有关的皮损天然免疫炎症反应在此过程中受到了抑制[4]。但目前对于银屑病皮损组织中Th17细胞和Treg细胞两类细胞在使用他克莫司软膏进行治疗过程中的具体变化情况的相关报道较少。

1资料与方法

1临床资料：符合静止期寻常型银屑病的临床诊断标准。均来自我院皮肤科门诊。排除标准：（1）面部存在银屑病皮疹而需要进行治疗的患者；（2）具有全身皮损面积超过10%，病情严重、需要通过药物进行系统治疗者；（3）3个月内使用过维A制剂、皮质类固醇激素及免疫抑制剂；1个月内使用治疗银屑病的系统药物的患者；（4）具有心、肝、肾疾病且病情较为严重的患者；（5）妊娠或哺乳期妇女。病例组为静止期寻常型银屑病患者50例。男32例，女18例。年龄20～65岁，平均36.5岁。病程5个月～8年。正常健康对照组50例，患者无皮肤疾病及其它疾病，均来自进行健康查体的正常皮肤组织，男27例，女23例，年龄18～60岁，平均39.5岁。两组在年龄、性别等方面比较无统计学意义（P>0.05）。标本均手术取材。所有标本取材后迅速经过10%福尔马林溶液固定，然后脱水，再进行石蜡包埋。本研究经过医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

2方法

2.1 治疗方法

我们对观察组使用他克莫司软膏进行治疗（外用0.1%他克莫司软膏—商品名：普特彼，注册证号:H20140603 国药准字J20140148），2次/d，疗程4周。对照组不用药。每1周患者复诊1次，记录不良反应。治疗前后需要对患者进行PASI评分。

2.2免疫组化法

我们采用免疫组化法观察重要的炎性因子在他克莫司治疗前、后的表达水平情况。具体实验步骤如下

[5]：（1）烘箱温度调至67℃，将4.3.1制作好的石蜡切片组织放置到烘箱中进行烘片，烘片时间为2 h，然后将切片脱蜡至水，并用pH=7.4的PBS对组织切片进行冲洗3次，每次冲洗时长3 min；（2）在微波盒内加入一定量的柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0），将已经脱蜡水化清洗干净的组织切片用耐高温塑料切片架盛放，随后放入已经加热至沸腾的柠檬酸盐缓冲液中，微波设置为中档对盛放组织切片的微波盒进行处理，时间为10 min，处理完毕的微波盒经流水作用待到自然冷却后，将组织切片取出并对其进行冲洗，冲洗顺序为蒸馏水2次，PBS为2次，每次3 min；（3）在冲洗干净的组织切片上每张滴1滴3%的双氧水后，于室温下对其进行孵育起到阻断内源性过氧化酶作用，时间为10 min，孵育后的切片使用PBS进行冲洗，分别冲洗2次，每次3 min；（4）在室温下滴加5%的BSA封闭液对组织切片进行封闭，封闭时间20 min，将多余的液体轻甩除去；（5）封闭后的组织切片每张加1滴相应的一抗（浓度为按原液1︰100稀释）后进行孵育，在室温下组织切片孵育时长为2 h；（6）使用PBS对组织切片进行冲洗，分别冲洗3次，每次5 min，除去PBS后，再在每张切片上加1滴聚合物增强剂，并于室温下再次进行孵育，时间为20 min，继续使用PBS液对组织切片进行冲洗3次，每次冲洗3 min；（7）去掉残留的PBS液后，再在每张组织切片上加1滴生物素化二抗，并于室温下进行孵育，孵育时长30 min，毕后继续用PBS液对切片进行冲洗3次，每次5 min；（8）在洗净的切片上再滴加试剂SABC进行免疫组化分析，于室温下进行孵育，孵育时长20 min，并用PBS进行冲洗4次，每次冲洗时长5 min；（9）残留的PBS液弃掉后，分别再加1滴新鲜配制的DAB液于每张组织切片上，将切片置于显微镜下进行显色观察，依据显色程度及时对反应进行终止；（10）采用苏木紫对组织切片进行复染，用0.1%HCl进行分化，分化后的切片用自来水进行冲洗，接着蓝化，再用不同浓度的酒精对蓝化的切片进行梯度洗脱干燥，并用二甲苯进行透明，最后经中性树胶对切片进行封固并晾干，待后观察。

2.3 免疫组化结果判定

本实验综合评分的标准是通过阳性细胞的百分比量和染色强度来进行的[6]，其中阳性细胞百分比的判断标准，为5个×400倍随机视野的阳性细胞百分比的平均值，无阳性细胞即阳性细胞百分比为0%时评定为0分，阳性细胞在0-25%、26%-50%以及51%-75%间分别为1分、2分和3分，超过75%的阳性细胞百分比量评定为4分；对细胞的染色情况进行积分，用以表示染色强度的大小，并按照染色后的颜色深浅对其进行评定，无着色、淡黄色、棕黄色以及棕褐色分别评定为0分、1分、2分以及3分。对各切片的显微镜观察结果进行分析，将阳性细胞百分比量和染色强度的评分进行相加作为综合评定标准：0分为阴性，将结果为1-3分的评定为弱阳性(+)，中度阳性(++)评分为4-5分，强阳性(+++)评分标准为6-7分。

3.统计学方法

临床数据采用SPSS20.0对结果数据进行分析，计数资料通过百分数（%）表示，用卡方检验；计量资料用均值±标准差来表示，用t检验，P＜0.05为差异显著。实验数据均采用使用Graph Pad Prism 7.0版软件进行统计分析。所有结果均表示为平均值±SD。通过非成对的T-test进行统计分析以确定差异。p值：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

4结果

4.1 临床疗效比较

本次研究发现他克莫司软膏治疗银屑病患者过程中，有2例患者在治疗初期出现局部红斑、刺痛，3天后症状消失，未出现其它不良反应。治疗后PASI评分降低明显，治疗前后差异具有统计学意义。见表1、图2

图1：他克莫司治疗银屑病前后PASI评分比较

表1他克莫司治疗银屑病前后PASI评分比较

4.2

两组治疗前后RORγt、Foxp3、IL-17和IL-10的免疫组化分析

我们收集了经过0.1%他克莫司软膏治疗4周后观察组和对照组的皮损组织，并且对组织进行免疫组化染色分析，结果显示：观察组银屑病皮损组织中RORγt的表达阳性率显著低于对照组正常组织（P<0.05），Foxp3的表达阳性率显著高于对照组正常组织（P<0.05），差异具有统计学意义；观察组银屑病皮损组织中IL-17 的表达阳性率高于对照组（P<0.05），IL-10的表达阳性率低于对照组正常组织（P<0.05），差异具有统计学意义；并且使用ImageJ软件进行定量分析，结果如图2。

图2.3.3 （A）观察组和对照组皮损组织的免疫组化图，主要观察指标是RORγt、Foxp3、IL-17和IL-10。

（B）各指标免疫组化的定量分析

5 讨论

近年来发现他克莫司可用于自身免疫性疾病或免疫相关性疾病。在皮肤病领域，外用他克莫司软膏被用于治疗多种疾病，如特应性皮炎、口腔扁平苔藓、白癜风、银屑病等,美国及德国指南推荐[7]，外用制剂可以使用0.1% 他克莫司软膏，1-2 次/d( 面部的起始剂量为0.03%，随后增加到0.1%) ，治疗8周后，间擦部位及脸部银屑病的患者中有65%被清除或几乎清除，而安慰剂组为31%,明显低于他克莫司组。宗长青[8]在治疗一项未成年人寻常型银屑病观察者发现，他克莫司替代激素治疗，不仅疗效好，副作用低。他克莫司[9 ]软膏在与卡泊三醇的一项对照临床研究中发现，效果明显，副作用相对于卡泊三醇组明显偏低，值得临床推广。他克莫司通过与细胞内的免疫嗜素FK结合蛋白(FK-BP)相结合发挥抑制作用。在银屑病的发生过程中，使用他克莫司进行治疗时发现，由于T淋巴细胞的活化被抑制使得发病环节同时被阻断，从而发挥治疗银屑病的作用[10] 此外，细胞的转化生长因子(TGF-β)可以经由角质通过他克莫司作用上调形成，TGF-β的生成对Toll样受体(TLR)的表达进行了抑制，从而使得与银屑病发病有关的皮损天然免疫炎症反应在此过程中都受到了不同程度的抑制[9 11]。在银屑病发生发展过程中，由于自身反应性T细胞的不断被激活以及有效免疫机制在机体内的缺乏，提示Treg细胞数量减少或者功能障碍可能与T细胞的不断被激活以及有效免疫机制缺乏密切相关，因此推测Treg细胞数量减少与银屑病的发生有着密切关系[12]。并且与正常健康人群相比，在经过治疗后， Treg细胞比例以及Foxp3的表达量在患者体内的显著增高，说明随着病情好转Treg细胞比例以及Foxp3的表达量逐渐恢复。还有研究表明[13]，皮损Treg细胞发挥了重要作用，皮损Treg细胞数量的减少加剧了银屑病的恶化。这些研究资料进一步阐明了在银屑病的发生发展过程中，Treg细胞数量的减少和功能下调共同发挥了关键作用。Treg细胞还能够分泌一种对银屑病有重要影响的抑制性细胞因子IL-10[14]。在将IL-10应用于银屑病临床治疗的研究中发现[15]，IL-10能够发挥其抗炎作用，对机体中多种促炎细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达进行抑制，并能够同时对Th1细胞免疫应答进行抑制，从而使得Th2细胞介导的体液免疫因此得到了促进，IL-10的保护作用让银屑病患者的病情得到显著改善，进一步说明了IL-10在银屑病发生发展过程中有着重要作用。Th17细胞及相关细胞因子在银屑病的发生过程中的重要作用，大量的研究发现银屑病患者皮损区和非皮损区的IL-17较正常人表达量增加，并且IL-17在皮损区的表达水平又较非皮损区高[16]。在Th17细胞分化过程中RORγt转录激活因子也起到了关键作用，当RORγt的表达受到抑制，使得未致敏Ｔ细胞向Th17细胞分化受到了抑制，外周血中的RORγt对炎性Th17细胞分化具有指导作用，还能够对IL-17的表达进行调节。另有[17]研究对Thl7细胞的分化进行了深入探讨RORγt与Thl7细胞在银屑病的发病过程密切相关。因此认为在对自身免疫性疾病的研究中，RORγt能够作为治疗的一个重要靶点[18]。

在有关免疫平衡的研究中发现Th17细胞(T helper cell 17, Th17)与Treg细胞（regulatory T cell, Treg）[19]在维持细胞免疫平衡中发挥着重要的作用。Th17细胞与Treg细胞是两种独立CD4+T细胞亚群，它们在发挥免疫功能方面与Th1、Th2细胞有所不同，对于来源于Th0细胞的Th17细胞主要通过分泌IL-17、IL-22等细胞因子等来发挥生物学效应。近年来[19 20]有研究发现：Treg细胞在某些炎症状态下能够与炎症相关的Th17细胞发生相互转化；在银屑病患者体外实验表明Treg细胞受到刺激后，能够产生出一组能分化IL-17A的细胞，并且使得RORγt表达水平增高，Foxp3表达受到抑制；随着Treg细胞在银屑病患者中继续分化，Foxp3的表达在IL-23作用下进一步减弱，即使在RORγt水平不高的情况下，Foxp3的表达减弱也并未受到明显影响。作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的曲古抑菌素A，对于银屑病患者体内Th17细胞转化为Treg细胞具有抑制作用，也能够影响Th17/Treg的免疫平衡。Th17细胞和Treg细胞在功能上相互拮抗，并在分化上Th17细胞和Treg细胞相互影响，在正常情况下，Th17细胞和Treg细胞保持相对平衡，对于维持机体的免疫稳定具有重要作用[20]。

本研究采用分子免疫组化技术对正常人群和寻常型银屑病患者治疗前后皮损组织中RORγt 、IL-17、 Foxp3和 IL-10的表达情况进行检测。研究结果显示：相较于正常人群组织，在寻常型银屑病皮损中RORγt、IL-17具有较高表达量，而Foxp3、IL-10的表达水平明显降低。结果提示：在银屑病患者局部皮损组织中，Th17的细胞反应得到了提升，而Treg细胞的免疫抑制功能减弱明显不足，进一步证实了Th17/Treg细胞的失衡在寻常型银屑病局部皮损组织中发挥着重要作用。检测Th17/Treg细胞变化可作为诊断银屑病的辅助指标以及他克莫司软膏治疗银屑病患者的疗效评价指标。。

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