高效液相色谱法测定不同产地火麻仁中胡芦巴碱的含量

高效液相色谱法测定不同产地火麻仁中胡芦巴碱的含量

熊春兰

广西仙茱制药有限公司，广西壮族自治区柳州市，邮编545000

摘要：该产品是一种以桑科植物为原料的干燥熟果，经过处理后按照标准汤剂的主要品质指标进行颗粒加工处理而成。可治疗血虚津亏、肠便干燥等病症。目的：采用 高效液相色谱法对火麻仁中胡芦巴碱进行含量测定分析，为2015年《药典》规定的标准物质含量测定提供参考。方法：以 Hypersil-氨酸柱为载体，在流相乙腈-水（80:20, V: V），检测波长为265nm。结果：胡芦巴碱在0.104~1.04微克的范围内有较好的线性关系，r为0.9999(n=6)，样品的加样回收率为100.7%, RSD为1.56%(n=9)；在10批次火麻仁药材的胡芦巴碱含量检测中，其质量分数为0.6504~0.9931mg·g-1。结论：胡芦巴碱是火麻仁药材及饮片的主要成份，它的萃取和含量测定方法简单结果准确，是控制火麻仁药材品质的重要指标测定方法。

关键词：高效液相色谱；火麻仁；胡芦巴碱

Abstract：This product is a formula granule prepared from the dried and ripe fruit of Cannabis sativa L.a Moraceae plant, and processed according to the main quality indicators of standard decoction. Clinically, it is mainly used for intestinal dryness and constipation, blood deficiency and fluid deficiency. OBJECTIVE: To establish a method for the determination of fenugreek in hemp seed by high performance liquid chromatography, and to provide a basis for the content determination items of hemp seed index components in the 2015 edition of the Pharmacopoeia. Method: Hypersil amino column, mobile phase acetonitrile-water (80∶20, V∶V), detection wavelength 265nm. RESULTS: The injection amount of fenugreek had a good linear relationship in the range of 0.104~1.04μg, r=0.9999 (n=6), the recovery rate was 100.7%, RSD=1.56% (n=9); 10 batches of hemp The content of fenugreek in the herbal kernels was 0.6504~0.9931 mg·g-1. Conclusion: Fenugreek is a characteristic component in hemp seed medicinal materials and decoction pieces. Its extraction and content measurement methods are simple and easy to operate, and the results are reliable. It can be used as an indicator component for quality control of hemp seed medicinal materials.

Key words: high performance liquid chromatography; hemp seed; fenugreek

火麻仁又名麻子、麻子仁、大麻子，是一种大麻属的桑科植物，干燥、成熟的果实通常比较饱满，种子颜色呈乳白色。山东的泰安和烟台地区是火麻仁最好的产地。《神农本草经》中记载了火麻仁的药性。《本草拾遗》中有“春麻，初春种，有毒性，春末生，可入药。”《图经本草》中有一句话：“麻蕡，一名麻勃，麻上花勃勃者，七月七日采。麻子九月采，入土者不用”。如今所用的火麻仁，与《本草纲目》中所述一致。

1火麻仁的药学鉴别研究

1.1火麻仁的性状鉴别

细心观察火麻仁，会发现其外观为卵状、灰绿或灰黄，色有光泽，两侧有棱角，尖端稍尖，底部呈圆，有圆状的果柄痕迹。其外观为4至5.5毫米，直径2.5至4毫米，呈白色或灰色或黄色的网格结构。是一种很易碎的水果。气味微弱，味道清淡。种皮色青，胚乳色白，果皮薄脆，易碎。

1.2火麻仁植物形态鉴别

野外观察火麻仁的原植物形态，其为一年生直立草本，高1到3米，在树枝上有浓密的灰色伏毛。叶互生，下叶是对生的，完全裂开，一般呈披针形。茎8到10厘米，叶面呈暗绿色，叶缘呈锯齿状，在植株早期，叶的背面带有灰色的绒毛。叶柄约3到15厘米，叶侧生，呈丝状。花单一，不同的植株，罕见的同株。花序是大的，顶端或腋下，花序大约25厘米；花为黄绿色，有薄膜，花被片，覆瓦状排列；外面被细伏贴毛，花丝极短，雄蕊，小花柄长约2到4毫米;雌花绿色，腋生，花被退化，每花有1苞片，子房无柄，近球形，花柱。瘦果单生，生于宿存黄褐色苞片内，卵形，果皮坚脆，种子为扁平状。

1.3火麻仁粉末特征

大麻素类、苯丙酰胺类、生物碱类、甾类、萜类、黄酮类、苷类、蛋白质等脂肪酸及其酯类为火麻仁主要有效活性成分。将火麻仁研磨成粉，用80目筛分，加入5%的水合氯醛，使其充分溶解，然后密封，用显微镜对其进行观察和摄像。火麻仁的子叶是一种多棱状的薄壁细胞区，其子叶中含有许多微小的粘稠颗粒和油脂颗粒，其颗粒大小为圆形、卵状、呈微黄或黄色。种皮上皮为一排由支撑细胞构成的单列栅栏细胞，其中种皮石细胞数量较多，呈群体分布。体表有许多棱形或不规则的斑点，颜色为黄色或浅黄色，胞间界线较浅，表面多棱形。侧视多数为卵形体，内含微黄物质，约15到40微米，30到60微米，壁厚度4到15微米，有丝状的导管，管胞较细。

1.4火麻仁的药用功效

2010药典中火麻仁药材仅有性状鉴别和薄层鉴别项，指标性成分的含量测定项缺失，不利于药材的质量控制。据文献报道，火麻仁中含有胡芦巴碱，经火麻仁醇提取物的化学成分的HPLC分析，并与胡芦巴碱的标准品对照，最终确定胡芦巴碱为火麻仁药材及饮片中的主要生物碱成分。胡芦巴碱对某些皮肤疾病有一定的抑制作用，同时具有降血糖的活性作用和抑制肿瘤的效果。火麻仁中含有的不饱和脂肪酸是一种具有抗氧化、抗自由基、抗肿瘤作用的植物。能明显降低 HDL和血清胆固醇的影响，从而降低高血压、心脏病、中风等疾病的发病率。火麻仁中富含脑细胞组织，具有调节植物神经、降低血脂的作用，同时针对抗炎性、降血脂、预防高血压、血管粥样硬化等功效显著。其中以甘油三脂为主要成分，对抗肿瘤活性具有明显作用。

2胡芦巴的药学鉴别研究

2.1胡芦巴的概况

胡芦巴是中国药典中被广泛应用的一种常用中药材，它是豆科植物胡芦巴的干燥、成熟的种子。胡芦巴广泛种植于亚非大陆和地中海地区，栽培成熟后被应用于食物和保健品。胡芦巴中含量最高的3种化学成分为胡芦巴胶，含量为20%~25%，皂苷含量为4%~8%，黄酮含量为1%~2%，这些物质被广泛地应用于治疗糖尿病、高胆固醇血症、脂肪肝和胃溃疡等疾病中，具有良好疗效。

2.2胡芦巴的药用效能

胡芦巴含有胡芦巴碱、胆碱、龙胆宁碱、番木瓜碱等，胡芦巴碱是降低机体血糖的主要有效成分之一。胡芦巴碱具有降低胆固醇，促进神经组织再生和抗癌作用，同时具有抗氧化作用，可以延迟糖尿病的恶化和对其他的合并症进行抑制。胡芦巴碱是胡芦巴的主要成份，其抗氧化机理是：增加其抗氧化能力，并能抑制一氧化氮的合成，进而减少胰岛 B细胞的氧化损害，故推测胡芦巴碱对胰岛B细胞作用的分子机制可能与细胞增生、肥大、再生密切相关。对STZ诱导的新生儿糖尿病大鼠（非胰岛素依赖性糖尿病模型）采用胡芦巴碱(100mg/g每天)进行4周治疗，结果发现胡芦巴碱治疗组大鼠的血清肌酸酐水平显著降低，肾小球滤过率有所提高，肾组织中抗氧化酶和膜结合酶活性降低，肿瘤坏死因子和羟脯氨酸含量增加，这表明胡芦巴碱对糖尿病大鼠肾脏的各种生化指标均有显著改善作用。

2.3胡芦巴碱的碱降血糖机制

胡芦巴碱，豆科植物胡芦巴的提取物，多栽培。主产安徽、四川、河南。其作为单体化合物，在很多植物中存在，如紫茉莉、冬瓜子等。作为单体化合物，对其降糖活性研究便不涉及专以胡芦巴为原料进行提取，而应通过购买或选用专门的纯化技术获得胡芦巴碱纯品。目前已报道的胡芦巴碱降血糖机制，主要为：修复受损胰岛、增加胰岛素含量、改善胰岛素敏感性、提升体内抗氧化酶活性及降低脂质过氧化等。

3实验部分

3.1仪器与试药

SPD-10AVP型紫外检测器;LC-10AT型双泵高效液相色谱仪(日本岛津)；KQ-250DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FA1004B电子天平(上海精密仪器)。胡芦巴碱对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇(A.R.)；乙腈(C.P.天津市大茂化学试剂厂)；实验用水选用超纯水。

3.2色谱条件

大连伊力特HypersilNH2(4.6x250mm,5微米）色谱柱；流动相乙腈-水(80∶20，V∶V)；流速1.0mL·min-1；柱温为25℃；检测波长265nm；按照胡芦巴碱峰法，其理论塔板数不得少于10000。

3.3对照品溶液制备及线性关系考察

将2.60mg的胡芦巴碱作为对照，精密称重，置于5毫升容量的瓶子内，用甲醇溶解。按刻度进行配制，并将其用作控制溶液。将1毫升贮存液体精确计量，置于10毫升容量的瓶子内，用甲醇进行刻度稀释，制备出52μg·mL

-1的对照液。进样量依次为2、6、10、14、18、20μL，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，得回归方程为y=1.2×106x+7650，胡芦巴碱在0.104~1.04μg范围内呈良好的线性关系(r=0.9999，n=6)。

3.4供试品溶液的制备

将大约1.0克的胡卢巴粉（40目筛网），精确称量，然后将其置于一个柱塞圆筒内，然后精确地加25毫升20%的乙醇，密塞，称量，并置于1小时；20摄氏度超声波作用10分钟，3次超声波，待冷却到室温后，称量；用20%的乙醇补充失去的质量，摇动，过滤，再提取剩余的滤料，用0.45微米的微孔过滤液将其过滤。

3.5精密度实验

将相同的火麻仁药材按照序号2.3中的规定进行精确称量，制备样品，6次连续进样，测定了样品的保存时限为0.23%和峰值 RSD=1.05%，表明仪器精密度良好。

3.6稳定性试验

精密称取同一火麻仁药材按 2. 3 项下方法制成 供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24h 测定峰面积。 平均峰面积为 588806. 5，RSD=1. 304%(n=6) 。表明 供试品溶液在 24h 内基本稳定。

3.7重复性试验

对相同的火麻仁6个样品进行精确称量，按照2.3规定的工艺配制，采用2.1个色谱柱进行分析，结果表明胡芦巴碱含量的平均值为1.031mg·g-1，RSD=1.055%，，该工艺具有较高的重现率。

3.8加样回收率试验

取已知胡芦巴碱含量(0.9626mg·g-1)的药材(产地河北)9份，每份约0.5g，精密称量，3份为一组，置具塞锥形瓶中，每组精密加入低、中、高浓度胡芦巴碱对照品贮备液，按2.3项下方法制备供试品溶液，结果平均加样回收率100.7%，RSD=1.56%(n=9)。

3.9样品含量的测定

从不同产区各提取1克左右的火麻仁，精密称量后，按照2.4项下的方法制备样品的溶液，并在上面的层析中进行测定，其色谱峰为2，并将其峰位进行测定；用标准曲线代替，得到了胡芦巴碱在试样中的浓度，如表格1所示。

A 胡芦巴碱对照品

B 火麻仁样品

图1 胡芦巴碱对照品和样品的HPLC图

表1火麻仁中胡芦巴碱的含量测定结果

4结果与讨论

4.1对于火麻仁药材定义的规范

2005版药典规定火麻仁为“桑科植物大麻……的干燥成熟果实”；而2010版药典则为“桑科植物大麻……的干燥成熟种子”。这种情况在各版中国药典中反复出现，比较混乱。显微鉴定表明，大麻的果实是由果皮和种子两部分组成，而种子则又由种皮和种仁两部分组成，与文献记载一致。目前，记载混乱的原因可能是，火麻仁作为润肠通便的良药，其有效部位应为种子中的油脂，所以描述为“种子”；然而去除果皮后的种子含油量太高(大于50％)，容易酸败变质而不易保存，因此，该药材在采收、加工、流通、储存、销售等环节中，均为果实的形态，故而描述为“果实”。我们对火麻仁果皮和种子的化学成分进行了初步研究，结果表明二者的成分种类及含量均有着巨大的差别，因此，规范火麻仁药材的定义尤为必要。通过对历代本草著作的考察，我们发现火麻仁除了润肠通便作用之外，还有“祛瘀”、“杀虫”等功效，且以“果实”入药。综合考虑其在流通、储存等过程中的可操作性，以及对目前实际药材市场的可指导性，初步拟定火麻仁药材为“桑科植物大麻……的干燥成熟果实”。而去除果皮的种子部分，由于油脂含量较高，药效较好，且不含有大麻酚类毒性成分，初步将其拟定为火麻仁饮片。

4.2胡芦巴碱作为指标性成分的选定原则

由于火麻仁饮片使用的是其种子部分，因此，所选取的指标性成分必须是种子中的特征成分，而不能选取仅在果皮中存在的成分，这样才能采用同一种指标成分对火麻仁药材和饮片同时进行质量控制。检测结果表明，火麻仁果皮和种子中均有的胡芦巴碱分布，因此，采用胡芦巴碱作为指标成分是比较适合的。

4.3 2010 药典的检测方法

2010药典在测定胡芦巴药材中的胡芦巴碱含量时，选用了C18反相键合色谱柱，考虑到反相柱的应用较为普遍，笔者初期也采用了C18作为固定相，该方法在测定生物碱样品时需要使用十二烷基磺酸钠等离子对色谱模式。然而，实际操作中发现，离子对色谱存在以下不足：体系平衡时间较长(约需平衡3h)；色谱峰分离度的重现性不佳；保留时间漂移较大；盐浓度较高，对色谱柱和色谱仪的寿命影响较大，因此，改用了氨基键合硅胶作为固定相。经3根不同品牌氨基柱在3台不同品牌色谱仪上进行考察，结果表明，当氨基柱柱效不低于10000时，能得到峰型对称、出峰时间适中、保留时间稳定、分离度高的色谱图，因此，最终选定了氨基键合硅胶作为固定相。

4.4胡芦巴碱的提取

胡芦巴碱是一种极性化合物，以内盐形式存在，易溶于水，甲醇，乙醇等极性溶剂，不溶于乙醚，氯仿等低极性溶剂，文献在提取方法上多采用超声提取法[10-12]。本文选择不同比例的甲醇-水对采用超声法对其提取，通过单因素考察及正交试验表明，胡芦巴碱的最优提取工艺为：甲醇浓度为20%，料液比为1∶25，提取时间为10min，温度为20℃，超声提取3次。

5结论

本文对10批不同产地的火麻仁药材中胡芦巴碱进行了含量测定，结果分布在0.6504-0.9931mg·g-1范围内，初步拟定火麻仁药材中胡芦巴碱含量不得低于0.65‰。目前，国内关于火麻仁的文献多集中在脂肪酸类、大麻酚类化合物等，而对火麻仁中生物碱进行的含量测定研究进行分析的较少。本实验以胡芦巴碱为主要组份，研究了从火麻仁中萃取胡芦巴碱的方法，采用氨基键合色谱柱为固定相，建立了火麻仁药材中胡芦巴碱的高效液相色谱分析方法，以期为2015版中国药典中火麻仁的含量测定项提供相关依据。

参考文献

[1]朱江,蔡明宸,王鑫,夏林波,邓仕任.非水反相色谱法测定火麻仁中甘油三酯含量[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(13):53-55.

[2]吴发明,李敏,王道清.火麻仁中脂肪油和蛋白质成分含量比较研究[J].现代中药研究与实践,2011,25(03):68-70.

[3]夏林波,邓仕任,郭莹.HPLC法测定火麻仁中α-亚麻酸的含量[J].化学工程师,2011,25(03):17-18+20.

[4]韩娜,赵建邦,宋平顺.气相色谱法测定火麻仁中亚油酸及α-亚麻酸的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(03):83-85.

[5]姜华,尹湉,赵余庆.胡芦巴碱的生物分布与药理作用[J].中草药,2008(04):638-640.

[6]张博,徐志洲,沈永,于晓慧,陈蕾.《中华人民共和国药典》药包材标准体系构建的调研与分析[J/OL].医药导报:1-11.

[7]张景朋,张卿硕,韩利平,蒋明亮.高效液相色谱测定防腐木中IPBC含量的方法研究[J/OL].木材科学与技术:1-8.

[8]段营辉,朱樵苏,黄澜,陈惠玲,李玲玲.高效液相色谱法同时测定清肺抑火丸中13种成分的含量[J].中国医院药学杂志,2022,42(14):1399-1404.

[9]周楚楚,杜鹏,孟雅,李志辉,张礼,郭修平,张宇佳,郑稳生.肾上腺素注射液中肾上腺素磺化物的HPLC检测方法研究[J/OL].药学学报:1-13.

[10]王开心,刘曼婷,彭胡麟玥,许煜晨,蔡梦如,曲昌海,董晓旭,尹兴斌,倪健.《中国药典》2020版一部收载矿物药及含矿物药中成药的质量标准分析与探讨[J/OL].中华中医药学刊:1-13.

[11] Zhou H X , Feng-Zhi W U , Wang G L , et al. Advance on Hemp Seed Oil[J]. Food Research and Development, 2013.

[12] Mesbah M ,  Premachandran U ,  Whitman W B . Precise Measurement of the G+C Content of Deoxyribonucleic Acid by High-Performance Liquid Chromatography[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1989, 39(2):159-167.

[13] Araki A ,  Sako Y . Determination of free and total homocysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.[J]. Journal of Chromatography B Biomedical Sciences & Applications, 1987, 422(none):43-52.

[14] B R L H A ,  B S C M A . Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate[J]. Analytical Biochemistry, 1984, 136( 1):65-74.

[15] Basch E ,  Ulbricht C ,  Kuo G , et al. Therapeutic applications of fenugreek.[J]. Alternative Medicine Review A Journal of Clinical Therapeutic, 2003, 8(1):20.

[16]  Yoshikawa M ,  Murakami T ,  Komatsu H , et al. Medicinal Foodstuffs. IV. Fenugreek Seed. (1) : Structures of Trigoneosides Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, and IIIb, New Furostanol Saponins from the Seeds of Indian Trigonella foenum-graecum L.[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1997, 45(1):81-87.

熊春兰，女，1978.04、汉族、广西柳州人、硕士研究生、制药、研究方向：配方颗粒含量测定