呼吸道多病原高通量快速检测方法的研究

呼吸道多病原高通量快速检测方法的研究

怀清杰*(通讯作者),梁爽,李友平,张炳丽,宋晓琳,李学东

哈尔滨市疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150056

[摘要]  目的：建立新冠、流感等常见呼吸道病原高通量快速检测方法，为呼吸道传染病防控提供技术支撑和技术保障。方法：采用实时荧光RT-PCR方法和恒温扩增微流控芯片法分别检测新型冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等多种病原，比对两种方法结果的符合率，建立高通量多病原快速检测方法。结果：719份样本实时荧光RT-PCR方法检出新冠病毒58份、流感病毒45份、呼吸道合胞病毒0份，103份阳性病毒样本恒温扩增微流控芯片法检出新冠病毒55份、流感病毒44份、呼吸道合胞病毒0份。另选新冠、流感、呼吸道合胞病毒均阴性样品30份进行检测，结果均为阴性。两种方法新冠病毒阳性检出符合率为94.83%，流感病毒阳性检出符合率为97.78%，新冠、流感、呼吸道合胞病毒均阴性符合率为100%。结论：恒温扩增微流控芯片法对引起呼吸道综合征常见病原包括新冠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等多种病原可以多指标并行检测，实现多病原快速检测，为呼吸道传染病诊断提供技术支撑。

[关键词] 呼吸道多病原；高通量快速检测方法

呼吸道传染病是人类面临的主要公共健康问题之一。引起呼吸道传染病的病毒有很多种，主要有流感病毒、新冠病毒、呼吸道合胞病毒等。新冠病毒疫情自2019年开始流行至今已有3年，对人民群众生命安全和身体健康造成了严重威胁，也引起社会恐慌和不稳定，给中国和全球经济造成重大损失。早期发现病例在新冠病毒疫情防控方面是关键，诊断是重要的依据，新冠与流感等其他常见呼吸道病原的鉴别诊断愈发重要。快速检测可以有效的提升呼吸道传染病的检测效能，助力病患的及时诊断和治疗，对于疫情防控战役提供技术支撑和技术保障。

1  材料与方法

1.1对象  2021年1月至2022年1月，收集呼吸道综合征样本，首先采用实时荧光RT-PCR方法分别检测新冠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒，挑选新冠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒的阳性样本和均阴性样本，采用恒温扩增微流控芯片法同时进行检测，比对两种方法结果的符合率，建立高通量多病原快速检测方法。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器 全自动核酸提取仪（SSNP-9600A）、实时荧光定量PCR仪（ ABI Q7 ）、高通量恒温扩增仪(RTiscochip-W)。

1.2.2 核酸提取  采用硕世生物科技有限公司的核酸提取试剂盒，按操作说明提取病毒核酸。

1.2.3 实时荧光RT-PCR方法检测  新冠采用武汉明德生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒进行荧光PCR检测，流感采用江苏硕世生物科技股份有限公司生产的流感病毒核酸检测试剂盒进行荧光PCR检测，呼吸道合胞采用上海之江生物科技有限公司生产的呼吸道合胞病毒核酸测定试剂盒进行荧光PCR检测，结果判定参照说明书。

1.2.4 恒温扩增微流控芯片法检测 采用博奥晶典生物科技有限公司生产的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒同时进行新冠、流感、呼吸道合胞病毒核酸检测，结果判定参照说明书。

2  结果

2.1 实时荧光RT-PCR方法检测呼吸道病毒检出情况  719份样本检出病毒阳性103份，其中新冠病毒58份、流感病毒（乙型）45份、呼吸道合胞病毒0份。见表1。

2.2 恒温扩增微流控芯片法同时检测几种呼吸道病毒检出情况  103份阳性病毒样本检出新冠病毒55份、流感病毒（乙型）44份、呼吸道合胞病毒0份。另选新冠、流感、呼吸道合胞病毒均阴性样品30份进行检测，结果均为阴性。见表1。

2.3 两种方法结果比较 实时荧光RT-PCR方法单项呼吸道病毒检测与恒温扩增微流控芯片法几种呼吸道病毒同时检测结果比较，新冠病毒阳性检出符合率为94.83%，流感病毒阳性检出符合率为97.78%，新冠、流感、呼吸道合胞病毒均阴性符合率为100%。见表1。

表1：两种方法检出呼吸道病毒符合率情况

3  讨论

3.1  新冠病毒等呼吸道综合征诊断是目前科学界与公共卫生领域的一项难以应付的挑战。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第九版）指出“新型冠状病毒肺炎轻型表现需与其他病毒引起的上呼吸道感染相鉴别；新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别，尤其是对疑似病例要尽可能采取包括快速抗体检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测。”钟南山院士指出，新冠肺炎与流感的鉴别也很重要，他称恒温扩增微芯片是一种特殊的方法，可以实现同步对多个患者进行检测，并对新冠病毒和A、B型流感，以及现存的其他病毒进行区分。新冠疫情持续存在，到了冬天，流感的发生率高了，届时新冠与流感的鉴别诊断愈发重要，否则流感患者以为是新冠患者，新冠患者以为是流感患者，他们之间就会出现互相传播，甚至出现合并感染造成病情进一步恶化。本研究从2021年1月至2022年1月收集的呼吸道综合征样本，只检出了新冠病毒、流感病毒，没有检出呼吸道合胞病毒，故没有呼吸道合胞病毒的数据。研究期间，哈尔滨地区流感流行株为乙型流感，没有检出甲型流感病毒，故只有乙型流感病毒的数据。

3.2 常规检验新冠病毒、流感病毒等呼吸道病原时检测流程复杂、耗时长、单次检测只能输出一种检测指标。而本项目研究采用恒温扩增与微流控芯片相结合，将提取的DNA模板加入微流控芯片中进行恒温扩增，对引起呼吸道综合征常见病原包括新型冠状病毒、甲型H1流感病毒、甲型H3流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒等多种病原高通量快速检测，可以多指标并行检测，且检测速度快，实现多病原同时快速检测，为及时发现新冠病例及无症状感染者，为新型冠状病毒肺炎与流感病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎感染鉴别诊断提供技术支撑，对新冠疫情的预防及控制具有重要的实用价值。本研究两种方法结果比较个别项目出现个别标本结果不符合，原因可能为不同方法本身的差异，或不同方法对样品的特异性、精确度的不同等原因。新冠病毒的原因还可能为恒温扩增微流控芯片法检测的是S基因和N基因，而实时荧光RT-PCR方法检测的是ORF1a/b基因和N基因，检测目标基因有不同，所以出现个别标本结果不符合。

3.3 新冠肺炎疫情对人民群众生命安全和身体健康造成严重威胁，也引起社会恐慌和不稳定，疫情发生以来我国采取的包括限制人群聚集、延缓经济活动等措施，导致需求减弱、生产放缓、贸易受限，对我国的经济造成明显影响。随着全球疫情的蔓延，世界经济也受到严重冲击。只有积极有效地进行防治，才能保障人的生命健康，从而节约医疗资源，减少社会、家庭、患者各种负担。在面对传染病疫情的时候，能够快速准确的对病原体进行诊断是当务之急。因此加强实验室建设，提升传染病检测能力，探寻敏感、特异、快速的新冠病毒检测方法是疫病防控迫切需求的。

3.4 由于研究在有限的时间内标本量有限，数据还有待于在以后的应用中进一步完善。

[项目] 黑龙江省卫生健康委科技计划项目（2020-54）（*通讯作者：怀清杰，E-mail：huaiqingjie@163.com）