HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度

HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度

朱双燕,李燕,何静,邵鑫

乐山市人民医院  药学部  四川省乐山市 614000

摘要 目的;建立HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度，方法：色谱柱为：Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），流动相为：0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（PH=3.2）：甲醇=80:20；流速为1mL.min-1；柱温30℃；检测波长：236nm。结果：万古霉素在质量浓度1~100mg.L-1内线性关系良好，r=0.99965，定量下线为1mg.L-1，日间、日内精密度良好（RSD均<15%），低中高质量浓度下的绝对回收率和提取回收率均>85%。结论：本方法操作简单，结果准确，适合用于人血清中万古霉素的检测。

关键词  万古霉素  HPLC TDM

Abstract：objective:To establish HPLC method for determination of vancomycin in human serum.Method:The chromatographic column was Agilent Eclipse Plus C18 (4.6×250mm, 5μm) with mobile phase: 0.01mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution (PH=3.2) : methanol =80:20; The flow rate was1mL.min-1; Column temperature 30 ℃. Detection wavelength: 236nm.Ｒesults:Vancomycin had good linearity in the range of 1-100mg.L-1 (r=0.99965), quantification was 1mg.L-1 (RSD <15%). The absolute recovery and extraction recovery of vancomycin at low, medium and high mass concentration were >85%.Conclusion：The method is simple, accurate and suitable for the determination of vancomycin in human serum.

Keyword:vancomycin  HPLC  TDM

万古霉素为三环糖肤类抗生素，对革兰阳性细菌有强大的抗菌作用，尤其对目前临床较为棘手的严重耐药金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染有较好疗效，且不易产生细菌耐药性，因而深受临床重视由于万古霉素具有耳肾毒性和肾毒性，且个体差异较大[1]，应用时常需进行血药浓度监测（TDM），特别是对于老年患者和肾功能不全者，需通过TDM来及时调整给药方案，以避免耳、肾功能损害[2]，万古霉素的血药浓度测定方法，已报道的有微生物法、荧光偏振免疫法和高效液相色谱法（HPLC）等，本研究拟通过建立适宜 HPLC 法，建立快速测定血清中万古霉素浓度，以用于临床 TDM 及药代动力学研究。

1材料

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，MS105DU电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Vortex-2涡旋混匀仪（上海沪析实业有限公司）；L500-A低速离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）；MICRO21R低温高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；UPTA20超纯水机（上海力辰邦西仪器科技有限公司）

1.2试剂与药品  万古霉素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130360-201302，纯度99.8%），乙腈和甲醇（色谱级，Tedia），血清为用红色采血管管采集健康人血离心所得。

2方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（PH=3.2）：甲醇=80:20；流速为1mL.min-1；柱温30℃；进样体积：10μL；紫外检测波长：236nmnm。

2.2溶剂配制

2.2.1 对照品溶液  精密称取对照品溶液9.98mg，用流动相溶解并定容值10mL，得到质量浓度为0.998g.L-1的万古霉素储备液，置-80℃冰箱冷藏备用。

2.2.2血清样品处理 血样于 3500 rpm 离心 10 min，吸取500 μL 上层血清，加入2mL EP 管，加入800μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1min，在4℃，12000rpm离心10min，取上清液于10ml的EP管中，加3ml二氯甲烷，于3500 rpm离心10min。吸取上清液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，加入液相小瓶的内衬管中，进行色谱分析。

2.3方法学验证

2.3.1 专属性 在本实验条件下，万古霉素的保留时间为6.590min，考察空白血清、空白血清加万古霉素、患者血清样品的色谱图，见图1-3，结果表明万古霉素色谱分离良好，血清中的内源性物质均不干扰血清中万古霉素的分析。

图1：空白血

图2空白血+标准品

图3：患者血清

2.3.2 标准曲线  取空白血清450μL，分别加入一系列不同浓度的万古霉素各50μL，使万古霉素的最终质量浓度分别为1、2.5、5、10、25、50、100mg.L-1，按2.2.2项血清样品处理，测得万古霉素峰面积，以测得的峰面积为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得到相应的标准曲线和回归方程：Y=6.3340x-3.3811（r=0.99965）。结果表明，血清中的万古霉素质量浓度在1-100mg.L-1范围内，线性关系良好。血清中万古霉素的最低定量线为1mg.L-1。

2.3.3精密度试验  配制万古霉素质量浓度为5、20、50mg.L-1的低、中、高3种浓度血清样品各5份样品，按照2.2项处理血清样品，连续测定5天，计算日内和日间紧密度，见表1。由表中结果可知，低、中、高三个浓度血清样品日内紧密度和日间紧密度均小于15%。

表1日间、日内精密度和回收率结果

2.3.4回收率试验  配制万古霉素质量浓度为5、20、50mg.L-1的低、中、高3种浓度血清样品各5份，按照2.2项处理血清样品，将实测浓度与加入浓度之比作为相对回收率，用流动相替代血清按照2.2项处理对应浓度对照品溶液所测浓度比作为提取回收率，见表2，相对回收率和提取回收率值均在85%-115%，RSD均<15%。

表2回收率结果

2.3.5 稳定性试验 取低、中、高三个质量浓度分别考察：①含标准品血清，未经处理，分别在4℃，-20℃保存，分别在0，24，72h，30天取样按照2.2项下处理后测定；②含标准品血清，反复冻融3次；③血清样品按照2.2项下处理后，分别在4℃，-20℃保存，分别在0，24，72h，30天取样测定；每次平均测5份血清样品，结果表明万古霉素在以上条件下稳定性良好。

表2含标准品血清-4℃和-20℃条件下保存稳定性

表3含标准品血清反复冷冻3次稳定性

表4血清样品处理后稳定性

3. 讨论

万古霉素的血药浓度监测主要有 HPLC、酶免疫法 (EMIT)和荧光偏振免疫法(FPIM ),比较这3种方法[3]，发现相同样品测定结果EMIT和FP1M均比HPLC法高，且3法标准曲线之间有一定的关联，这可能是万古霉素的代谢降解产物对EMIT和FPIM法有干扰。而对 HPLC法干扰少 。因此用HPIC法测定万古霉素方法稳定可靠。本实验采0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（PH=3.2）：甲醇=80:20，实验过程中发现万古霉素保留时间及峰形受流动相的pH影响大，若偏碱则出峰过前。偏酸则出峰过后，酸性条件时峰形较好

[4]。当pH=3.2左右时,保留时间较合适，峰形较好。对于万古霉素提取方法，万古霉素是水溶性大分子化合物，其分子量高达1486，一般采用蛋白沉淀法，若用10%硫酸锌沉淀血清蛋白，硫酸锌加入量过大时线性关系不理想，加入量少时，所得的蛋白沉淀较松散，需要长时间离心才能达到与上清液的完全分离，而且硫酸锌溶液放置时间过长，溶液易霉变和长菌，本实验采用乙腈沉淀后用二氯甲烷萃取法，经多次重复，此法快速，稳定，提取回收率高。

参考文献

[1]翟所迪,贺蓓,王睿《中国万古霉素治疗药物监测指南》解读[J]中国临床药理学杂志,2016,32（17）：1633-1636

[2]陈 明，西 娜，赵冠人HPLC⁃MS/MS检测万古霉素血药浓度方法的建立及应用[J]军事医学2019,43(8):420-624

[3]王瑞颖,易柳,郭宇鸽等万古霉素血药浓度快速监测方案的构建与应用[J]海峡药学2020，32（9）：48-51

[4]林忠，周鹏 ，孙渊HPLC法检测万古霉素血药浓度[J]中国临床药学杂志，2014，23（2）：92-96

课题：乐山市老年高血压患者达标率及影响因素研究

课题编号：乐山市科技计划项目：（18SZD111）课题负责人：朱双燕