基于生物信息学方法筛选儿童特异性皮炎免疫细胞浸润调控关键基因

基于生物信息学方法筛选儿童特异性皮炎免疫细胞浸润调控关键基因

谢万露 ,董建祥

柳州市中医院皮肤科,广西柳州,545001，中南大学湘雅医学院,湖南长沙,410013

[摘要]  目的：分析儿童特异性皮炎患者病变组织免疫细胞浸润模式，筛选调控关键基因。方法：自GEO数据库下载GSE107361数据集，使用Cibersort、WCGNA、Cytoscape等方法进行分析。结果：AD患儿病变组织DC浸润比值上升，肥大细胞浸润比值降低。DC浸润比值与CCL22、CXCL1表达量与呈正相关，与KRT19表达量呈负相关；肥大细胞浸润比值与CXCL1、CXCL8、GZMB等基因表达量呈正相关。结论： CCL22、CXCL1、KRT19、CXCL8、GZMB等基因与儿童AD病变皮肤组织免疫细胞浸润比值相关。

[关键词]  特应性皮炎；儿童；免疫；趋化因子

Identify the key genes of immune cell infiltration regulation in childhood specific dermatitis based onBioinformatics method

Wanlu Xie (Dermatology Department of Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, LiuZhou, Guangxi province,545001), Jianxiang Dong (Xiangya school of medicine, Central South University, Changsha, Hunan province,410013)

[Abstract]Objective: This research analyzed the pattern of immune cell infiltration in lesion tissues of childhood atopic dermatitis patients and screen the key genes regulating immune cell infiltration. Methods: GSE107361 data set was downloaded from GEO database. Cibersort, WCGNA and Cytoscape software were used to analyze. Results: The ratio of mast cell infiltration is decreased in atopic dermatitis children, while the ratio of DC infiltration is increased. The DC infiltration ratio was positively correlated with expression of CCL22 and CXCL1, while negatively correlated with KRT19. The expression of CXCL1, CXCL8 and GZMB were positively correlated with the mast cell infiltration ratio. Conclusion: CCL22, CXCL1, KRT19, CXCL8 and GZMB are significantly correlated with immune cell infiltration in childhood atopic dermatitis patients.

[Keywords]  Atopic dermatitis; Children; Immune; Chemokines.

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性炎症性皮肤病，最基本的特征是皮肤干燥、慢性湿疹样皮损和明显瘙痒[1]。本病通常初发于婴儿期，1岁前发病者约占全部患者的50%，1 ~ 12月婴儿AD患病率达30.48%[2]

AD的始发因素尚不明确，Elias 等[3]提出了 AD 发病的“outside-inside-outside”模型，认为遗传等因素引起的皮肤屏障功能损伤可能是AD 的第一步。皮肤屏障破坏使AD患者更容易摄取过敏原，从而促发过敏性炎症反应，加重AD[4]。在免疫系统方面，儿童和成人AD患者中存在Th1/Th2/Th17/Th22亚群的异常激活和Th1 /Th2 分化失衡[5]。Brunner等[6]收集了儿童与成人AD的组织样本，发现儿童AD以TH2和TH17/TH22为中心的炎症较强。儿童AD的免疫机制研究仍然相对较少，本研究采用Cibersort、WGCNA、PPI网络等方法对儿童AD病变组织的免疫浸润模式进行分析，为儿童AD的发生机制提供新的见解。

1 材料与方法

1.1  数据来源

自GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载GSE107361数据集，该数据集使用GPL570平台进行测试，含19例AD患儿的病变皮肤组织样本和匹配的对照正常组织样本，共38个病变患儿样本，以及18个健康儿童的皮肤组织样本，受试者年龄均小于5岁[6]。

1.2Cibersort分析

使用rtracklayer包将下载的GSE107361原始counts数据转换为TMP数据。使用Cibersort法进行反卷积分析。

1.3WGCNA构建与免疫浸润相关的基因模块

选取方差最大的1000个基因构建基因表达模块，并与表型进行关联性分析。导出模块内基因至STRING数据库（https://string-db.org/）构建PPI网络。使用Cytoscape软件cytoHubba插件计算模块连接度。采用线性回归分析，进一步筛选调控免疫细胞浸润的关键基因。

1.4  统计学处理

使用t检验比较LS-NC、NL-NC组之间计量资料，使用配对t检验比较LS与NL组之间计量资料。使用卡方检验比较计数资料的差异。使用SPSS 24.0软件进行数据分析，使用R语言进行可视化（版本为3.6.3）。P<0.05时认为结果具有统计学意义。

2  结果

2.1  样本基线信息比较

将样本分为3组，19个AD患儿的病变皮肤组织样本为LS（lesion）组，19个配对的AD患儿对照正常组织样本为NL（normal lesion）组，18个健康儿童的皮肤组织样本为NC（normal control）组。两组之间的基线信息差异无统计学意义（表1）。

表1  基线信息比较

2.2  Cibersort法预测组织免疫浸润比值

22中免疫细胞浸润分数比值见图1。将上述22种细胞合并为4类进行比较，结果显示，LS组相较NC组，DC总浸润比值升高，而巨噬细胞和肥大细胞总浸润比值下降（图2）。

             图1   22种免疫细胞浸润比值。*:P<0.05; **:P<0.01; ***:P<0.001.

  图2  4类免疫细胞总浸润比值。*:P<0.05；**:P<0.01;***:P<0.001.

2.3  WGCNA法构建与免疫浸润相关的基因模块

将年龄，性别及4类免疫细胞总浸润比值，与6个模块进行相关性分析（图3）。绿色模块共15个基因参与构成PPI网络，核心基因有PIP、CFTR、KRT19等（图4）。蓝绿色模块共183个基因参与构成PPI网络，核心基因有IL1B、CXCL8、CCL2、CXCL10等（图5）。

图3  基因模块与6种表型相关性热图

图4绿色模块PPI网络

选取模块关键基因与免疫细胞浸润分数进行线性回归分析。结果显示，绿色模块中KRT19（R2=0.36）表达量与DC浸润比值呈负相关（图6B、C）；蓝绿色模块中CCL22（R2=0.55）表达量与DC浸润比值呈正相关，CXCL1（R2=0.63）、CXCL8（R2=0.57）、GZMB（R2=0.50）的表达量与肥大细胞比值呈负相关（图6）。

图5蓝绿色模块PPI图。

图6线性回归分析。绿色点表示NC组，黄色点表示NL组，红色点表示LC组。

3讨论

本研究发现LS组和NL的DC浸润比值较NC组显著上升，而巨噬细胞的浸润比值则下降，提示儿童AD患者未病变的皮肤组织也存在免疫浸润的异常，与既往研究结果相符[7-9]。LS组的肥大细胞浸润比值较NL组和NC组降低，由于AD病变部位免疫细胞总数会增加，尚不能确定肥大细胞绝对数量是否减小。在许多AD模型中，皮肤损伤处肥大细胞浸润的数量增加[10]。

此外，我们从mRNA水平筛选了3个可能与DC浸润比值增加及9个与肥大细胞浸润比值降低有关的调控基因。

趋化因子是小的 (6-14 kDa) 分泌蛋白，根据四个半胱氨酸残基的排列不同将其分为四个不同的类别：CC、CXC、XC 和 CX3C[11]。CCL2是白细胞的趋化剂，其配体为CCR2[12]。CCL22可诱导原始T细胞向Th2亚群分化，其配体为CCR4[13]。CXCL1与细胞表面受体CXCR2结合诱导白细胞的定向迁移和激活[14]。CXCL10 在功能上被归类为 Th1 趋化因子，与受体 CXCR3 结合并通过激活和募集白细胞来调节免疫反应[15]。多项研究揭示了儿童和成人AD患者外周血中CXCL10[16-18]、CCL2[18]、CCL22[16-18]含量增加，并与疾病的严重程度相关。

GZMB（Granzyme B，颗粒酶B）通常由淋巴细胞分泌，与穿孔素共同介导靶细胞的凋亡

[19]。在AD小鼠模型中，GZMB表达与疾病严重程度和瘙痒成正相关；在分子机制上，GZMB裂解钙黏蛋白和FLG，损害上皮屏障功能[20]。

KRT19、SELL、MMP-1/3均有一些生物信息学证据支持其可能参与AD，然而关于这些基因对免疫浸润的影响及如何参与AD的机制尚无报道[21-23]。

本文通过生物信息学方法，分析了儿童AD患者病变与非病变组织的免疫浸润模式，筛选了3个可能调控DC浸润及9个可能调控肥大细胞浸润的关键基因。然而，生物信息学能提供的信息是有限的，期待未来的基础和临床研究能够更深入的探究AD免疫浸润改变的机制。

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