腹膜透析液用聚氯乙烯软袋在微生物限度检查方面的研究

腹膜透析液用聚氯乙烯软袋在微生物限度检查方面的研究

孙宽慰  ,周玉红

天津金耀药业有限公司   天津开发区黄海路221号  邮编：300457

摘要：我公司现依据《中国药典》2020版1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法收载的微生物限度检查法对腹膜透析液用聚氯乙烯软袋进行微生物限度检查，以保证检测方法符合要求。确保该方式在本实验室现有实验条件下具有良好的适用性、稳定性及准确性，能够确实有效的控制与保障产品质量。

引言：根据要求，需对腹膜透析液用聚氯乙烯软袋微生物限度检查方法进行适用性试验验证。验证包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数适用性试验验证。按照腹膜透析液用聚氯乙烯软袋的理化特性与生物学特性，制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行腹膜透析液用聚氯乙烯软袋微生物限度检查；若不符合，应重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准，以确定适合的检查方法，提高效率的同时也要保障产品的质量。

1. 仪器与材料：

1.1仪器与材料

试验用供试品：选取三批腹膜透析液用聚氯乙烯软袋。

1.2验证用设备：

表1：试验用设备及耗材一览表

1.3验证用玻璃器具、仪器：验证中所用计量器具均须经计量部门校验合格后，方可使用。

1.4验证用培养基及缓冲液：验证中所用的培养基均须经过适用性试验，培养基和试液均须经过121℃灭菌15分钟，并且应保证在验证使用过程中都在灭菌的效期之内，如超出之后不再使用。

1.5试验用培养基及缓冲液：

     表2：验证用培养基及缓冲液一览表

1.6试验用菌种：

表3：验证菌种一览表

铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为需氧菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株；验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

2.试验方法及结果

2.1 供试液制备：

2.1.1供试品：腹膜透析液用聚氯乙烯软袋

2.1.2稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液

2.1.3制备方法：

2.1.3.1试验组供试液制备：取1个供试品，用灭菌剪刀将袋子的外边缘全部剪开，将袋子的内表面打开，平铺于净化工作台面上，加入0.1mL菌液（不大于10000cfu/mL），在内表面均匀涂布后用镊子夹住一个已用稀释剂润湿的灭菌棉球将袋子的内表面进行完全擦拭，将所得棉签放入25mL试管中，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，振摇10分钟，使之混匀，即得试验组1:10供试液，备用。每株菌株各制备一份。

2.1.3.2样品组供试品制备方法：取1个供试品，用灭菌剪刀将袋子的外边缘全部剪开，将袋子的内表面打开，平铺于净化工作台面上，加入0.1mL稀释剂，在内表面均匀涂布后用镊子夹住一个已用稀释剂润湿的灭菌棉球将袋子的内表面进行完全擦拭，将所得棉球放入25mL试管中，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，振摇10分钟，使之混匀，即得供试品对照组1:10供试液，备用。

2.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验验证：

2.2.1试验组：从2.1.3.1中吸取1mL供试液注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

2.2.2菌液组：吸取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10mL至25mL试管中，加入0.1mL菌液（不大于10000cfu/mL），混匀后从中吸取1mL供试液注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

2.2.3供试品对照组：从2.1.3.2中吸取1mL供试液注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

2.2.4铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉采用胰酪大豆胨琼脂培养基于30～35℃培养，白色念珠菌和黑曲霉菌采用沙氏葡萄糖琼脂培养基于20～25℃进行培养。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养不超过5天，观察菌落生长情况，培养结束后点计菌落数并报告。

2.2.5验证公式：

试验组的比值=

2.2.6结果判断：

完成三次独立的平行试验后，计算每一次验证试验的结果，即试验组的比值的结果，应在0.5～2范围内。若试验组的比值均在此范围内，则平皿计数方法验证可行。

若任一次试验中任一试验菌株试验组比值不在0.5～2范围内，应按照《偏差管理SMP》进行分析。

2.3数据汇总

表4：需氧菌结果汇总表

3.小结：

在试验的结果中，如果供试品对照组应没有检出试验菌，菌液组检出试验菌。若试验组检出试验菌，则可按照该供试液制备方法进行该供试品检查；若试验组未检出试验菌，先按照从操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件等方面逐一查找原因，然后按照偏差处理程序进行偏差分析，如为操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件、检测等因素，处理后应重新进行验证试验，如非上述因素造成试验组未检出试验菌，则表明供试品在此检验条件下不适用，应与方法提供单位联系，进行新的方法研究。

参考文献：

[1]中国食品药品检定研究院,国家药包材标准，2015年10月第1版，中国医药科技出版社，YBB00172002-2015.

[2]国家药典委员会，中华人民共和国药典，2020年版，四部，北京：中国医药科技出版社，2020：160-165.

[3]中国药品生物制品检定所，中国药品检验标准操作规范，中国科学技术出版社，2015:01.