抗阿尔茨海默病药物石杉碱甲研究进展

抗阿尔茨海默病药物石杉碱甲研究进展

袁萌1,,贾雅茜1,,成露馨1,,张玉1,,张笑1,,韩文霞1*

西安医学院，陕西 西安 710021

【摘要】阿尔茨海默病在医学上又被称为老年痴呆症，临床表现为神经退行记忆衰减。乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物治疗老年痴呆，其基本原理为抑制脑内乙酰胆碱的分解、提高脑内胆碱能神经递质的传递，从而有效帮助患者改善认知功能。乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在治疗不同严重程度的老年痴呆患者时，均能有效帮助患者改善精神行为和认知功能，提升日常生活质量。治疗老年痴呆症临床首选药物之一为第二代胆碱酯酶抑制剂—石杉碱甲，石杉碱甲药物是从蛇足石杉植物中提取获得，与其他几种乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物相比具有较突出优势，当前医学临床领域对石杉碱甲需求越来越大。经过20年的医学临床研究，植物提取可使石杉碱甲的萃取率达到93%，纯度由3.04%提高到了90%以上，但植物资源面临濒危灭绝的局面已成为当下最突出的瓶颈，因此开发石杉碱甲原料药新的获得途径至关重要。石杉碱甲的宿主植株蛇足石杉人工栽培难度大且化学合成由于诸多难以克服的缺陷而无法实现工业化，生物合成成为关注焦点。生物合成的研究主要集中在新的可产石杉碱甲的菌株的发现与开发、生物合成石杉碱甲的关键酶基因研究以及生物转化等方面，为实现生物合成石杉碱甲奠定理论基础，有着非常广阔的前景。

【关键词】阿尔茨海默病；乙酰胆碱酯酶抑制剂；石杉碱甲；提取工艺；临床研究比较；生物合成

阿尔茨海默病在医学上又被称为老年痴呆症，在整体痴呆患者中占比超过50%[1]，在临床上老年痴呆症表现为记忆力衰退、失语等，随着我国人口红利消失，出现越演越烈的老年化趋势，作为全球较为流行的神经退行性疾病，老年痴呆症严重影响着患者的身心健康和正常生活，出现老年痴呆症的家庭会遭遇严重的经济损失，从官方数据得知，截止2018年，全球共计老年痴呆患者5000万人，这使得全球遭遇超过1万美金的经济损失，根据大数据趋势可以计算得出，在2050年全球老年痴呆患者人数将再创新高，人数将保持在1.52亿人[2]。

据研究结果及临床资料表明，从蛇足石杉中提取获得的石杉碱甲（Huperzine A，HupA），能够有效抑制胆碱酯酶的活性，改善患者记忆力，具有毒副作用小、高效等优势，已被纳入第二代胆碱酯酶抑制剂类药物，针对老年痴呆患者等疾病有很好的治疗效果。随着全球人口老年化趋势越发严峻，医药市场对HupA的需求越来越高。当下，HupA主要是依托蛇足石杉植物提取获得，但植物生长迟缓，从孢子萌发到成熟通常需要15～20年，蛇足石杉中HupA含量虽然不高[3]，但作为传统中药，社会需求大、供求矛盾日益加剧，遭到了掠夺式采集，资源日渐锐减[4-7]，因此，寻求HupA来源的问题以及探索新兴的体外合成方法刻不容缓。近些年来的研究主要围绕蛇足石杉的人工栽培、植株体外离体培养、HupA化学合成、HupA生物合成等方面展开，而人工栽培生长环境特殊，HupA含量有限；采用化学合成的方式，药物具有成本高、活性低和难度大的弊端，很难实现大规模生产；国内外还开展了一系列HupA资源植物的繁育方法研究并逐步建立起相对高效的体外扩增方法[9]，但离体培养因植株生长环境苛刻，加之离体培养污染等瓶颈，在大规模培养上依旧存在困难。内生真菌的分离、发酵及其生物合成近几年日渐兴起，但含量依旧甚少，还有待进一步开发与研究。

1. HupA植物提取与纯化

研究人员们在原有的提取工艺上，利用酸浸、酶辅助超声等方法对HupA进行提取，再进行分离纯化，方法主要有微波、氯仿、双水相萃取等。

1.1酸浸提

HupA呈碱性，因此可采用酸溶液浸泡，从植物中提取HupA，学者张馨等人将蛇足石杉在10倍体积、pH=1.0的H2SO4进行12小时的酸化，再进行超声波二次酸化，每次酸化间隔30分钟，完成酸化后，进行合并过滤，再使用NaOH进行酸碱度调整，最终用体积相同的氯仿萃取2次，经3批验证，提取率大大提高。

1.2酶辅助超声

超声波提取的原理是利用超声波的热效应、机械效应和空化效应，从而增强介质分子的穿透性，并增强介质分子的运动速度，从而将生物中的有效成分提取出来，酶辅助超声作为一项节能、高效、环保的提取方法，其优点在于提取率高、温度低、提取时间短等特点，通过Duncan和Box-Behnken法进行成分提取，可实现工艺优化的条件包括：纤维素酶占比6%，酶解120分钟，料液比为1：65，超声114 分钟，超声功率为760 W。基于上述条件进行野生和组培的蛇足石杉中的HupA提取，提取率分别为0.04087%和0.05105%，利用传统的临床手段进行药物提取与传统酸提法和乙醇回流法相比较，分别提高了0.94倍和1.497倍。由此可见，利用酶辅助超声法进行药物提取，该提取方法较为理想，能够有效缩减有机溶剂的消耗，从而有效增强

HupA的提取率和纯度[9]。

1.3双水相萃取 

该提取方法是基于一定浓度的一种聚合物和无机盐的混合物或者两种具有不同水溶性的聚合物可通过自然萃取的方法进行药物提取，已被分离的物质，在进入双水相体系后，由于受到表面的电荷间作用力的应用，从而导致溶液的浓度存在差异，从而造成两相分离，很容易进行连续性操作，通常来说并不存在有机溶液残留的问题，设备较为简单，作用条件比较温和，利用EtOH/（NH4）2SO4双水相萃取工艺对野生和组培的蛇足石杉实现分离，从临床的使用结果表明，EtOH/（NH4）2SO4双水相体在临床的应用中，具有良好的选择性，通过EtOH/（NH4）2SO4双水相萃取后，分离溶液中的HupA，从而有效提升药物中的HupA纯度，EtOH/（NH4）2SO4双水相萃取工艺的优化应用人工神经网络（ANN）优化。其基础条件为，保持35.32℃的室内温度、pH= 8.85、质量分数分别为20.6%和38%的硫酸铵和乙醇，从此从溶液中萃取的HupA为92.87%；利用该工艺萃取溶液中的组培和野生蛇足石杉，溶液中药物的萃取率为90.16%和91.32%[9]。

1.4氯仿萃取 

该萃取方法是利用溶液中不同成分分配系数存在差异，而达到药物分离的目的。刘建廷等将千层塔在pH=3.0、10倍体积的盐酸中酸解45min，在55℃下超声波酸解三次，每次间隔实践为30min，再进行溶液的合并，完成溶液合并后，实行药物过滤，等到溶液的温度达到25℃时，使用氨水调整pH=9.0，再用10倍体积的氯仿将其萃取3次，提取率为79.4%，该提取条件是最优的。

1.5微波萃取 

该萃取方法是利用不同物质的微波吸收能力存在差异，进行个别组分加热，将被萃取的物质提取，该萃取方法具有的优点众多，包含萃取质量稳定[10]。在单因素实验的基础上，选定2.03%盐酸浓度， 20.04h浸提时间， 19:22液料比。若用硅胶色谱柱对HupA进行分离，得到的纯度和收率分别为48.13%和77.65%[11]。

2  化学合成Hup A

多年研究中，国际各领域学者在有关HupA菌株的研究较少，由于HupA在临床治疗老年痴呆症方面有着十分较突出的疗效，目前医学领域HupA应用范围越来越广，各领域对HupA的需求也不断扩大，从1989年至今，各国国家的学者已然提出多样化的药物化学合成法，但其在化学合成过程中具有的局限性难以克服，因此研究化学合成(-)-HupA甲具有良好的迫切性，但该部分的研究很少，相关报告在整个学术领域几乎没有，这对HupA的研发和发展具有限制作用，在之后的研究过程中，学者不断增强对合成药物的研究，并提出在未来的发展过程中，生物药物合成是未来药物发展的重要方向之一。

3 植株体外离体培养

3.1不同氨基酸对HupA的影响

陈曼等人以天冬氨酸、赖氨酸和色氨酸作为HupA的假定前体物质，培养蛇足石杉的叶状体，从而在提纯过程中，纯度更高，科学研究成果表明，在植物中添加天冬氨酸使叶状体增殖量衰减，却使得HupA和叶状体干物质积累量大大增加，但在植物中添加赖氨酸，会抑制药物元素的积累[12]。

3.2 外源添加物对HupA的影响

张小红团队通过添加前体物等，培育蛇足石杉组培苗，为了保证培养条件更加高效：可有效促进蛇足石杉成长，并提升药物产量，从而为药物植物生产提供新途径。他们通过前体饲喂方式发现添加一定量的赖氨酸可以促进HupA的积累[13]。

4  HupA生物合成及应用

4.1生物合成菌株的发现 

近年来，从不同的蛇足石杉植物中分离出HupA内生真菌的报道不多，例如 Acremonium sp. 2F09P03B, Blastomyces sp., Botrytis sp., Blastomyces sp. HA15, Shiraia sp. Slf14, Cladosporium cladosporioides LF70, Aspergillus flavus LF40, Ceriporia lacerata MY311, Hypoxylon investiens MY183, Alternaria brassicaeAGF041, Fusarium sp. Rsp5.2, Fusarium sp. C17 (Li et al. 2007; Ju et al. 2009; Ya et al. 2011; Zhi et al. 2011; Wang et al. 2011; Su 2011; Shaohua et al. 2014; Li-Hui et al. 2014; F. F. Zhang et al. 2015; Amira et al. 2019; Thanh et al. 2020; Olga et al. 2020)[15-27]。 然而，这些报道的真菌HupA的产量非常低，这些真菌对突变非常敏感，失去了

HupA的初始表达能力，这是HupA生物合成工业化的主要障碍。近几年研究首次报道发现的几种可产HupA真菌Mucor racemosus NSH-D、Mucor fragilis NSY-1、Fusarium verticillioides NSH-5、Fusarium oxysporum NSG-1、Trichoderma harzianum NSW-V，在HupA产力上是国内已发现菌株的1000倍，为进一步产业化开发生物合成HupA奠定了菌株基础[28-30]。

4.2寻找合成HupA的关键酶基因

对合成与代谢途径中的关键（限速）酶的了解与研究对于开展关于生物合成与代谢工程研究方面的工作来说至关重要。利用现代分子生物学和基因工程技术手段，克隆HupA生物合成途径的关键酶基因，研究关键酶基因对HupA生物合成的调控规律，寻找HupA的生物合成途径及其代谢调控机制，实施次生代谢工程，非常受临床医学追捧。有相关报道记载已获取部分蛇足石杉的转录信息，从中发现了可能参与蛇足生物碱的转录本，并发现了可能参与HupA的生物合成的基因[31]。在HupA合成中，该基因编码的蛋白定位于石杉碱生物合成途径下游石杉碱与HupA之间甲基转换的催化酶，使得HupA最终形成。

4.3 在生物转化方面的研究 

Ying等进行生物转化方面的研究，共计得到的新的转化产物4个，在临床实验中，使得研发人员十分惊喜的是该四个产物为真菌代谢物与HupA的结合体，该产物虽然从活性上来看，不及HupA和乙酰胆碱酯酶的效果，但和HupA的缓释药物前体ZT-1结构相似，可能具有ZT-1类似活性[32]。

5. 展望

研究数据表明卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐、HupA治疗老年痴呆患者，主要作用为抑制乙酰胆碱的分解和提高脑内胆碱能神经递质的传递，能够有效帮助不同程度的老年痴呆患者改善认知功能，提高生活质量，缓解精神行为症状，其中HupA在临床治疗时，能够有效帮助记忆障碍患者缓解认知障碍，提高老年痴呆患者的记忆商数，并在临床应用中有着最好的安全性。在临床治疗中，多奈哌齐与卡巴拉汀双管齐下，可有效帮助治疗老年痴呆患者，在医学领域非常值得推广；多奈哌齐联合HupA在临床医疗中可有效帮助患者抑制血清 MDA、NPY水平，并且在药物治疗中并不会增加药物的负面反应，两者的联合治疗是一种高效的治疗方案；加兰他敏在进行临床患者治疗过程中，能够有效帮助老年痴呆患者增强空间定位能力，有效改善患者空间能力障碍。HupA作为四种乙酰胆碱酯酶抑制剂中副作用最小的一种药物，其临床应用价值高。鉴于植物提取HupA资源面临瓶颈以及化学合成难度系数大，寻找合成HupA的关键酶基因、通过植株体外离体培养、发现新菌株等生物合成的方法愈来愈成为人们探索HupA来源的重要途径。

参考文献：

[1].Igri Kolaj , S. Imindu Liyanage , Donald F . Weaver . Phenylpropanoids and Alzheimer's disease : A potential therapeutic platform[J] . Neurochemistry International , 2018．

[2].PATTERSON C . World Alzheimer report 2018 : The state of the art of dementia research : New frontiers［EB/OL］. Alzheimer Disease International , 2018 . ［2020-03-10］. https: / / www . alz . co . uk /research / world – report - 2018．

[3].Ma X , Tan C , Zhu D , et al . A survey of potential huperzine A natural resources in China : The Huperziaceae [J] . J Ethnopharmacol , 2006 , 104(1/2) : 54-67.

[4].Szypula W J , Mistrzak P , Olszowska O . A new and fast method to obtain in vitro cultures of Huperzia selago (Huperziaceae) sporophytes , a club moss which is a source of huperzine A [J] . Acta Soc Bot Pol , 2013 , 82(4) : 313-320.

[5].徐贤柱, 涂艺声, 吉枝单, 等. 蛇足石杉离体培养物形态变化与石杉碱甲积累的研究

[J].植物学报, 2015, 50(06): 733-738.

[6].吉枝单, 涂艺声, 陈曼, 等. 蛇足石杉离体培养产石杉碱甲的条件优化及动力学研究[J].中草药, 2016, 47(03): 488-492.

[7].张小红, 李晓君, 杨雪飞, 等. 不同条件对蛇足石杉组培苗生长及石杉碱甲积累的影响[J]. 中国现代中药, 2016, 18(04): 472-477.

[8].唐承晨, 张纯, 王吉永, 等. 药用植物蛇足石杉内生菌研究进展[J].江苏农业科学, 2017, 45(07): 13-19.

[9].张小红. 蛇足石杉中石杉碱甲双水相萃取分离的工艺研究[D]. 合肥工业大学, 2016.

[10].张庭荟. 石杉碱甲提取工艺及药理功效研究进展[J]. 西部皮革, 2016, 38(02): 10-29.

[11].董海龙. 石杉碱甲提取分离工艺的研究[D]. 天津大学, 2010.

[12].陈曼, 涂艺声, 叶丽婻, 等. 氨基酸对蛇足石杉叶状体增殖及石杉碱甲积累的影响[J]. 植物学报, 2017, 52(02): 218-224.

[13].张小红, 李晓君, 杨雪飞, 等. 不同条件对蛇足石杉组培苗生长及石杉碱甲积累的影响[J]. 中国现代中药, 2016, 18(04): 472-477.

[14].Li Wan-kui , Zhou Ji-yan , Lin Zi-wei , Hu Zhi-bi (2007) Study on fermentation condition for production of huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrata . Chin Med Biotechnol . 2 : 254 – 259 (in Chinese) .

[15].Ju Zan , Wang Jun , Pan Sheng - li (2009) Isolation and preliminary identification of the endophytic fungi which produce Hupzine A from four species in Hupziaceae and determination of Huperzine A by HPLC . Fudan Univ J Med Sci . 36(4) : 445 - 449 (in Chinese).

[16].Ya Wang , Qing Gui Zeng , Zhi Bin Zhang , Ri Ming Yan , Ling Yun Wang , Du Zhu (2011) Isolation and characterization of endophytic huperzine A-producing fungi from Huperzia serrata.J Ind Microbiol Biotechnol. 38:1267-1278. doi: 10.1007/s10295-010-0905-4

[17].Zhi Bin Zhang , Qing Gui Zeng , Ri Ming Yan , Ya Wang, Zheng Rong Zou , Du Zhu (2011) Endophytic fungus Cladosporium cladosporioides LF70 from Huperzia serrata produces Huperzine A . World J Microbiol Biotechnol . 27 : 479–486. Doi : 10 . 1007/s11274-010-0476-6

[18].Wang Ya , Yan Ri-Ming , Zeng Qing-Gui , Zhang Zhi-Bin , Wang Di , Zhu Du (2011) Producing huperzine A by an endophytic fungus from Huperzia serrata . Mycosystema 30 : 255-262 (in Chinese) . doi : 10.13346 / j . mycosystema . 2011 . 02 . 003

[19].Su JQ (2011) Alkaloid and Huperzine A Production from Endophytic Fungi isolated from Huperziaceae . M . A . dissertation . Fuzhou , Fujian Normal University , China (in Chinese).

[20].Shaohua Shu , Xinmei Zhao , Wenjuan Wang , Guowei Zhang , Andreea Cosoveanu , Youngjoon Ahn , Mo Wang (2014) Identification of a novel endophytic fungus from Huperzia serrata which produces huperzine A . World J Microbiol Biotechnol .30 : 3101-3109 . doi : 10.1007 / s11274-014-1737-6

[21].Li-Hui Dong , San-Wei Fan , Qing-Zhi Ling , Bei-Bei Huang , Zhao-Jun Wei (2014) Indentification of huperzine A-producing endophytic fungi isolated from Huperzia serrata . World J Microbiol Biotechnol . 30 : 1011-1017 . doi : 10.1007 / s 11274-013-1519-6

[22].F . Zhang ,M . Z . Wang ,Y . X . Zheng ,H . Y . Liu ,X . Q . Zhang , S . S . Wu(2015) Isolation and characterzation of endophytic Huperzine A-producing fungi fromPhlegmariurus phlegmaria . BMC .84 : 701–709 . doi : 10.1134 / S0026261715050185

[23].Amira G . Zaki , Einas H . El-Shatoury , Ashraf S . Ahmed , Ola E . A . Al-Hagar (2019) Production and enhancement of the acetylcholinesterase inhibitor , huperzine A , from an endophyticAlternaria brassicaeAGF041 . Appl Microbiol Biotechnol . 103 , 5867-5878 . doi : 10.1007 / s00253-019-09897-7

[24].Thanh Thi Minh Le , Anh Thi Hong Hoang , Nhue Phuong Nguyen , Thuy Thi Bich Le , Ha Thi Thu Trinh , Thuy Thi Bich Vo , Dong Van Quyen(2020) . A novel huperzine A-producing endophytic fungus Fusarium sp . Rsp5.2 isolated from Huperzia serrate . Biotechnol Lett . 42 : 987-995. doi : 10.1007 / s10529-020-02836-x

[25].Olga Lidia Cruz-Miranda , Jorge Folch-Mallol , Fernando Martínez-Morales , Reinier Gesto-Borroto , María Luisa Villarreal & Alexandre Cardoso Taketa (2020) Identification of a Huperzine A-producing endophytic fungus fromPhlegmariurus taxifolius. Mol Biol Rep . 47: 489–495. doi : 10.1007 / s11033-019-05155-1

[26].ChoiKB ,MorishigeT ,ShitanN , etal .Molecularcloningand characterizationof coclaurine N-nethyl transferase from cultured cells of Coptis japonica [J] . J Biol Chem, 2002, 277(1) : 830-835.

[27].汪涯．一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌的分离和鉴定[J]. 菌物学报, 2011, 30(2): 255-262.

[28].Han Wen-Xia, Han Zhong-Wen, Jia Min, Zhang Han, Li Wei-Ze*,Yang Li-Bin, Liang Fei, Han Lu, Zhao Ning, Li Xiao-Feng. Five novel and highly efficient endophytic fungi isolated from Huperzia serrata expressing huperzine A for the treatment of Alzheimer’s disease, Applied Microbiology and Biotechnology, 2020, 104: 9159-9177.

[29].韩文霞, 李伟泽, 李小峰, 张寒, 杨时珍, 杜江凤, 景欢, 程传彬. 蛇足石杉中产石杉碱甲内生真菌的分离和鉴定[J]. 微生物学通报, 2017, 44(9): 2153-2160.

[30].韩文霞, 李伟泽, 李小峰, 张寒, 杨新华, 郭小溥, 王凯艳, 杨梅. 蛇足石杉内生真菌产石杉碱甲含量检测及真菌的鉴定[J]. 国际药学研究杂志, 2016, 43(6): 1112- 1116.

[31].唐承晨, 张纯, 王吉永, 等. 药用植物蛇足石杉内生菌研究进展[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(7): 13-19.

[32].Jack CRJr,Albert MS，Knopman DS，et a1．Introduction to the recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer’S Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’S disease．Alzheimers Dement，2011 ,(7) ：263-292.

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（202011840025）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（S202011840025）；校级大学生创新创业训练计划项目（121520025）；陕西省脑疾病防治重点实验室开放基金（20NBZD03）

通讯作者：韩文霞   E-mail: wenxiahanwendy@163.com