HPLC法测定人血浆中伏立康唑的浓度

HPLC法测定人血浆中伏立康唑的浓度

朱双燕,李燕,何静,邵鑫

乐山市人民医院  药学部    四川省乐山市 614000

课题：乐山市老年高血压患者达标率及影响因素研究

课题编号：乐山市科技计划项目：（18SZD111）课题负责人：朱双燕

摘要 目的：建立HPLC法测定人血浆中伏立康唑的浓度，方法：色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），流动相为乙腈：水=50:50；流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；检测波长：256nm。结果：伏立康唑在质量浓度0.2~20mg.L-1内线性关系良好，r=0.99961，定量下线我0.2mg.L-1，日间、日内精密度良好（RSD均<15%），低中高质量浓度下的绝对回收率和提取回收率均>85%。结论：本方法操作简单，结果准确，适合用于人血浆中伏立康唑的检测。

关键词  伏立康唑  HPLC TDM

Abstract：objective;To establish HPLC method for determination of voriconazole in human plasma.Method:The chromatographic column was Agilent Eclipse Plus C18 (4.6×250mm, 5μm), and the mobile phase was acetonitrile: water =50:50. The flow rate was 0.8 ml.min-1; Column temperature 30 ℃. Detection wavelength: 256nm.Ｒesults:Voriconazole had a good linearity in the range of 0.2-20mg.L-1 (r=0.99961), and quantification was 0.2mg.L-1 (RSD <15%). The absolute recovery and extraction recovery of voriconazole at low, medium and high mass concentration were >85%.Conclusion：The method is simple, accurate and suitable for the detection of voriconazole in human plasma.

Keyword:voriconazole  HPLC  TDM

伏立康唑是具有广谱抗真菌活性的第二代三唑类抗真菌药物，能抑制真菌细胞膜麦角甾醇的生物合成，从而影响真菌细胞膜的通透性性最终抑制真菌的生长。临床上作为侵袭性曲霉感染和克柔念珠菌感染的一线治疗药物[1]。但该药药动学呈现非线性特征，患者年龄、体质量、肝功能、基因多态性和合并用药等因素均会影响其在体内的过程，使得血药浓度个体间差异较大[2]。为了临床上避免血药浓度过高或过低疗效不佳或不良反应增多，有必要进行伏立康唑血药浓度监测。因此，我们建立了 HPLC 法测定人血浆中伏立康唑血药浓度，旨在为临床合理用药提供参考。

1材料

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，MS105DU电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Vortex-2涡旋混匀仪（上海沪析实业有限公司）；L500-A低速离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）；MICRO21R低温高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；UPTA20超纯水机（上海力辰邦西仪器科技有限公司）

1.2试剂与药品  伏立康唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100862- 201903，纯度99.8%），乙腈和甲醇（色谱级，Tedia），血浆为用EDTA管采集健康人血离心所得。

2方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈：水=50:50；流速为0.8mL.min-1；柱温30℃；进样体积：20μL；紫外检测波长：256nm。

2.2溶剂配制

2.2.1 对照品溶液  精密称取对照品溶液9.98mg，用流动相溶解并定容值10mL，得到质量浓度为0.998g.L-1的伏立康唑储备液，置4℃冰箱冷藏备用。

2.2.2血浆样品处理  精密移取180μL空白血浆，加入20μL标准品涡旋30秒，加入200μL乙腈沉淀蛋白，涡旋1min，在4℃，12000rpm条件下离心10min，取上清液20μL，进样分析。

2.3方法学验证

2.3.1 专属性 在本实验条件下，伏立康唑的保留时间为7.367min，考察空白血浆、空白血浆加伏立康唑、患者血浆样品的色谱图，见图1-3，结果表明伏立康唑色谱分离良好，血浆中的内源性物质均不干扰血浆中伏立康唑的分析。

图1：空白血

图2空白血+标准品

图3：患者血浆

2.3.2 标准曲线  取空白血浆180μL，分别加入一系列不同浓度的伏立康唑各20μL，使伏立康唑的最终质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mg.L-1，按2.2.2项血浆样品处理，测得伏立康唑峰面积，以测得的峰面积为纵坐标(Y)，对应的浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得到相应的标准曲线和回归方程：Y=16.7156x+1.963（r=0.99961）。结果表明，血浆中的伏立康唑质量浓度在0.2-20mg.L-1范围内，线性关系良好。血浆中伏立康唑的最低定量线为0.2mg.L-1。

2.3.3精密度试验  配制伏立康唑质量浓度为0.5、5、10mg.L-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份样品，按照2.2项处理血浆样品，连续测定5天，计算日内和日间紧密度，见表1。由表中结果可知，低、中、高三个浓度血浆样品日内紧密度和日间紧密度均小于15%。

表1日间、日内精密度结果

2.3.4回收率试验  配制伏立康唑质量浓度为0.5、5、10mg.L-1的低、中、高3种浓度血浆样品各5份，按照2.2项处理血浆样品，将实测浓度与加入浓度之比作为相对回收率，用流动相替代血浆按照2.2项处理对应浓度对照品溶液所测浓度比作为提取回收率，见表1，相对回收率和提取回收率值均在85%-115%，RSD均<15%。

表2回收率结果

2.3.5 稳定性试验 取低、中、高三个质量浓度分别考察：①含标准品血浆，未经处理，分别在4℃，-20℃保存，分别在0，24，72h，30天取样按照2.2项下处理后测定；②含标准品血浆，反复冻融3次；③血浆样品按照2.2项下处理后，，分别在4℃，-20℃保存，分别在0，24，72h，30天取样测定；每次平均测5份血浆样品，结果见表2，表3，表4，结果表明伏立康唑样品处理后应在4℃，-20℃保存，72h内检测，处理后样品的含量随着放置时间的延长，峰面积会逐渐增大，原因可能是处理后的样品中乙腈挥发，使得药物浓度增加。其余存储条件下，稳定性良好，RSD均<15%。

表2含标准品血浆-4℃和-20℃条件下保存稳定性

表3含标准品血浆反复冷冻3次稳定性

表4血浆样品处理后稳定性

3.讨论

伏立康唑于2002年5月被批准上市，是第2代三唑类广谱抗真菌药物，口服、静注给药均有很好的抗真菌活性，其中，口服吸收率极高，在1~2h 后血药浓度达到高峰，生物利用度高达90% ，伏立康唑体内药物吸收、分布、代谢、排泄均受到很多因素的影响

[3]，临床上常要求该药进行药物浓度监测，2016年9月中国药理学会治疗药物监测研究专业委员会发布了伏立康唑个体化用药指南，该指南明确了伏立康唑血药浓度监测的适应人群、采样时机、治疗窗、处置措施等ꎬ对于指导临床开展相关工作具有重要意义，目前国内外报道的测定方法主要有 LC-MS/MS法和HPLC法，考虑LC-MS/MS法样品处理较为复杂，仪器昂贵，并未在各家医院推广或普及，而HPLC具有分离度好、灵敏度高、专属性强、成本较低等优点[4],故国内医院多采用HPLC法，然而，文献多报道 HPLC 测定伏立康唑的方法大多采用内标法进行校正 (如:氟康唑、酮康唑、劳拉西泮、氯唑沙宗等)，但这使得样品前处理却较为繁琐,本研究我们直接采用HPLC外标法用甲醇沉淀血浆中蛋白的方法测定，样品前处理无提取等繁琐步骤，方法简便、快速、准确ꎬ且仪器稳定性、方法重现性均较好，本方法适用于在缺少内标情况下的快速TDM。

参考文献：

[1]陈恳、张相林、克晓燕等《伏立康唑个体化用药指南》解读[J].临床药物治疗杂志.2019,17(3):47-52

[2]史香芬，刘帅兵，孙志勇等二维液相色谱测定伏立康唑血药浓度的研究[J].药物分析杂志.2019.39(8):1404-1408

[3]史长城，楼 江，王 飞HPLC 法测定人血浆中伏立康唑的浓度[J]中国临床药学杂志.2018,27(4):235-238

[4]王晓晨、王思箭、刘林夕，伏立康唑个体化给药研究进展[J]中国抗生素杂志.2020,45(1):16-23