新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)无菌分装工艺验证

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)无菌分装工艺验证

张辛瑶,王彬,赵博欧,武连田

北京生物制品研究所有限公司  北京市  邮编：100000

摘  要：目前，国内已经上市的灭活疫苗包括3个灭活疫苗、2个重组亚单位疫苗和1个重组蛋白疫苗。由于新冠病毒具有一定的变异性，灭活疫苗保存条件、接种后质量控制等方面具有较大限制。为了保证灭活疫苗在保存条件下安全有效地投入使用, Vero细胞(BSM-2)作为细胞培养基中的病毒载体，已在世界卫生组织(WHO)正式批准上市。因此，如何在 Vero细胞培养基中稳定纯化并保证疫苗质量及稳定性，以达到良好免疫效果和最佳免疫原性成为研究重点。本研究针对新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）中常见缺陷及安全问题，针对其在无菌条件下进行纯化和无菌接种两种操作过程中不同菌株之间及不同菌株与细胞之间可能存在的安全隐患和可能存在的技术问题做了实验验证。

关键词：新型冠状病毒；灭活疫苗；无菌分装

一、Vero细胞的常见缺陷及原因

Vero细胞来源的新冠病毒灭活疫苗，具有较高的病毒含量和较强的细胞免疫原性，能够有效刺激机体产生中和抗体，从而抑制新冠病毒感染人体，进而达到灭活疫苗免疫效果。在培养基中，需要将不同种类的病毒载体用于 Vero细胞制备和接种等过程。目前常用的 Vero细胞制备方法包括HLA-Bst、 SHBL等。HLA-Bst是最常见、效果最好且特异性最强的一种病毒载体。SHBL是细胞来源的 V型亚型病毒载体之一。

1、生产工艺

目前常用的 Vero细胞生产方法有两种：基于GV-971的质粒制备和基于GV-971的载体制备。质粒制备工艺包括三步:1)细胞培养;2) Vero细胞悬浮培养;3)注射。根据原核疫苗（含细胞株）的制备工艺要求，生产过程分为三个阶段:1)疫苗抗原获得阶段;2)抗原生产阶段;3)抗原纯化阶段。由于现有的HLA-Bst或 SHBL生产技术存在一定局限性。通常采用的灭活药物为灭活核酸药物(PCR)和腺病毒载体（减毒）时产生病毒抗原所需的核苷酸不完全相同所导致；或者是所使用的重组蛋白不完全相同、病毒载体质量差异较大等原因导致上述工艺过程存在缺陷。因此，需要通过对生产过程中产生的病毒抗原进行分析、检测来验证疫苗所需制备工艺的正确性。

2、免疫原性

Vero细胞免疫原性一般为经减毒的HLA-Bst病毒（如CA-9、CA-13等）。对新型冠状病毒(COVID-19)疫苗来说，其主要通过激活 T细胞应答和杀伤 T淋巴细胞发挥作用。因此, Vero细胞接种后需要对这些细胞进行持续感染和增殖，以提高免疫原性。然而，随着新型冠状病毒的不断变异，原 Vero细胞中的抗体浓度可能会发生变化。病毒基因组结构存在较大变化，相应的细胞抗原也随之改变。因此可以通过调整原 Vero细胞的抗原含量来增强细胞免疫原性。例如用含高浓度病毒蛋白的培养基处理 Vero细胞后，通常在接种后2~3天出现诱导性抗原应答、而高纯度病毒蛋白（如CA-13、CA-13等）可能会在整个诱导过程中缺失或过度表达某些因子或蛋白（如CA-13等）在机体内无法完全表达而出现免疫原性下降等情况，从而影响疫苗效果。

3、病毒含量

Vero细胞通常在培养基中具有较高的病毒含量。目前用于临床应用的新冠病毒灭活疫苗中，含有的 Vero冠状病毒数量有限，且来源广泛，在体外培养后，不能有效诱导免疫应答产生抗体[8],因此需要在疫苗制备过程中通过加入病毒载体保持 Vero细胞中的病毒含量。常见病毒形态有：病毒颗粒、病毒粒子+ EV/AAV、重组基因、单核细胞、流感病毒、 SARS病毒、 NCoV病毒、埃博拉病毒等。病毒颗粒的大小对 Vero细胞的安全性、免疫原性和灭活效果均有很大影响。如表1所示，所有来源的新冠病毒灭活疫苗均具有极高的病毒含量[9]。

二、实验方案中涉及到的主要技术问题

本实验是采用与原研灭活疫苗相似的方法进行实验验证。试验方案如图1所示，首先对 Vero细胞(BSM-2)纯化及无菌接种过程中菌株的选择提供参考。纯化步骤包括纯化菌株及细胞（需同时满足抗原和抗体纯化):通过抗原的检测来确定 Vero细胞浓度，选择纯化工艺优化后的菌株；在纯化过程中需保证 Vero细胞表面的抗原含量大于原研灭活疫苗，以及该血清浓度高于原研灭活疫苗。然后通过接种到 Vero细胞上的核酸浓度来确定疫苗是否为新冠病毒有效表达物并测定抗体值（根据原研灭活剂所含特异性抗原（包括 T淋巴细胞受体阳性因子)),从而确定该血清是否可以在无菌条件下接种至 Vero细胞上。在无菌条件下将不同菌株接种并获得理想的血清后进行纯化。

1、无菌接种

从实验室移除 Vero细胞后，需要在4℃下放置24 h,接种过程中疫苗及 Vero细胞表面的抗原可能发生变化，影响疫苗的效力，因此必须严格按照使用说明书的要求对疫苗进行接种，以保证疫苗的有效性。接种步骤包括：①无菌琼脂混悬液培养；②琼脂接种后进行无菌接种；③灭菌、脱毒；④疫苗接种后24 h观察；⑤观察无菌后保存疫苗6 h;⑥冷藏保存至0℃。对各实验过程的无菌琼脂混悬液处理见图3和图4所示，无菌接种步骤均已完成并获得了良好的无菌苗种（图4)。其中无菌琼脂接种的条件为：接种温度0℃~4℃；接种时间24 h~72 h;培养基温度0℃~4℃；接种后6 h观察无菌情况；经脱毒后24 h以上不能发生变化。

2、无菌区内的交叉污染

均需设置缓冲区域，以防止空气飞沫污染。无菌区采用负压，确保外界空气进入无菌区时不会有飞沫和尘埃微粒进入[7]。在条件允许的情况下，采用分装柜将无菌容器与药品分开。其中, Vero细胞制备过程中，每一步均需要用消毒剂对分装柜进行消毒、灭菌，确保灭菌不会导致该区域内的人员感染；而疫苗制备过程中需要对制剂进行加热或使用消毒剂进行灭菌，以确保制剂不会受到影响或存在交叉污染。

3、成品包装规格要求

本实验采用的规格为20 mL的 Vero细胞专用袋，其使用标签建议标注“1-5-1”，即每个批号内仅有一种规格包装，且需保证袋内装有产品的具体数量及种类，确保袋内空间充足，不会发生因储存空间不足导致 Vero细胞无法放入袋内现象。由于本产品的特殊包装要求（如对不同工艺要求）还未出台其他规格的包装规格或建议生产企业参考相关文献对 Vero细胞专用袋的包装规格进行规定。为了确保疫苗质量和安全性，本试验采用了20 mL规格标签进行包装。对于不同的剂量要求的疫苗（不同批号和组别),将根据检验报告中所示要求进行相应的工艺验证和修改处理。

三、小结

实验结果表明，实验方法可行。纯化过程中产生的大量H2和 TBF可经常规培养基中较低浓度后（≤0.5μ g/mL)经无菌接种工艺获得最终无菌制剂。在接种过程中，可采用与实验方法一致的无菌培养基或灭菌培养基配方。为后续灭活疫苗质量控制及安全保障提供了可靠的实验依据和技术支撑。

参考文献

[1] 田盛举,张颖聪,杨雯娜,等. 新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)无菌分装工艺验证[J]. 国际生物制品学杂志,2021,44(6):310-314.

[2] 韩碧华,吴志伟,李敏捷,等. 新型冠状病毒灭活疫苗（Vero细胞）在60岁及以上人群中的安全性研究[J]. 中华预防医学杂志,2022,56(9):1295-1301.

[3] 朱立炜,陈国杰,姜凌,等. 合肥市新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)紧急接种期间安全性[J]. 中华疾病控制杂志,2021,25(7):802-805.

[4] 王瑞博,许定花,刘家胜,等. 双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗免疫原性及中和效价的测定[J]. 昆明理工大学学报（自然科学版）,2021,46(5):110-116.

[5] 乔亮明. 如何创无菌的疫苗生产环境[J]. 中国牧业通讯,2002(5):53.

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