蛛网膜下腔出血miRNA研究

蛛网膜下腔出血miRNA研究

吴俊

长江航运总医院  湖北 武汉 430010

［摘要］目的  探讨血浆miRNAs在蛛网膜下腔出血患者中的表达，并研究miRNAs表达水平与蛛网膜下腔出血患者相关性。方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（real-time PCR）检测血清miRNA21 和 miRNA155 在21例蛛网膜下腔出血患者中的表达水平，同时分析miRNAs的表达与蛛网膜下腔出血患者的关系。结果 在蛛网膜下腔出血患者中 miRNA21 和 miRNA155在血清表达水平是上调。结论 蛛网膜下腔出血患者血清miRNA21和miRNA155表达水平增高，可以早期预测蛛网膜下腔出血。

［关键词］蛛网膜下腔出血; 临床意义

蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage SAH）是多种病因所致脑底部或脑及脊髓表面血管破裂的急性出血性脑血管病，具有高病死率和高发病率的特点，有近一半的治愈者会出现长期的认知功能障碍而且不能恢复到之前的生理状态。

近年来有研究发现外周血中含有数目众多的循环miRNA，这些miRNA具有作为疾病相关血清学标志物的潜在优势 [1]。目前只有一小部分microRNAs生物学功能得到阐明。研究人员发现许多神经系统的microRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。

1 材料与方法

1.1  研究对象：收集长江航运总医院2018年5月-2018年12月神经外科收治的蛛网膜下腔出血患者21例,经临床及神经影像学检查（头颅CT或MRI）确诊，SAH患者的分级标准采用世界神经外科医师联盟(WFNS)委员会的蛛网膜下腔出血分级，GCS评分在3-8分，这些患者都在发病并入院就进行神经外科手术。

1.2 正常对照组 取得患者同意，经院伦理委员会许可，选自同期我院健康体检则15例（其中男性8例，女性7例）作为对照组，健康对照为经影像学确定无脑部相关病变的体检者。

1.3主要试剂 : miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型 miRNA检测试剂盒和miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自于TIANGEN公司.

1.4 miRNA取材方法：常规抽取外周全血，抗凝离心后分离血浆。按照miRcute miRNA提取分离试剂盒的操作手册用吸附柱吸附miRNA，所获RNA溶解于500UL H2O（无核糖核酸酶）中。紫外分光光度仪检测miRNA的浓度和质量，检测合格者-80 ℃冰箱冻存待用。

1.5 实时荧光定量PCR

取上述已经配好的miRNA60ng放在miScipt反转录试剂里反转录为cDNA，反转录条件为37℃1h、95℃5min。再进行实时荧光定量PCR检测，miRNA21的引物序列为5，-GGGGTAGCT

TATCAGACTGATGTTG-3, ，miRNA155的引物序列为5，-TCTGCTCATACTCTCCTGTC-3, ，内参U6的引物序列为5，-TTCGTGAAGCGTTCCATATTT-3, ，95℃15min；94℃15s,58℃30s,70℃34s,共40个循环。计算各标本平均CT值，以miRNA U6作为内参，将miRNA21、miRNA155的CT值减去miRNA U6的CT值作为△CT值, △CT值越低，则表达水平越高。计算标准化后的2-△CT值表示miRNA的相对表达含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件，计量资料以±s表示，患者与健康对照组进行方差齐性分析、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA纯度

抽提出来的miRNA的OD260/OD280值均在1.8-2.0之间。

2.2  miRNA21和miRNA155在SAH中的表达

两组患者的年龄、性别比较差异无统计学意义。SAH组患者血清miRNA21表达比健康对照组明显上调，比较差异有统计学意义（P＜0.05）,见表1.

* P＜0.05 为差异有统计学意义

3.讨论

蛛网膜下腔出血属于进展十分迅速的疾病，越早治疗取得的效果越好，相应病人的预后越好。但目前缺乏早期诊断指标， miRNAs具有明显的组织特异性，其在多种疾病中有不同的特异性表达谱，不同类型的miRNAs在脑动脉瘤等多种血管性疾病中都有特异性的表达［2］。目前对于循环miRNA的研究主要集中在肿瘤方面，例如Kurashige J等发现血清miR-21能作为食管鳞状细胞癌的一种新标志物。miRNA-21 是原癌miRNA，与多种肿瘤的发病相关［3］。miRNA155参与了多种肺部疾病的发生及恶化，尤其在肺部感染、肺部神经内分泌肿瘤及肺纤维化过程中特异表达增高。

本实验结果显示，miRNAs在SAH 中的表达水平存在差异，并与SAH显著相关，研究循环miRNA与SAH的预后的相关性。试验结果表明SAH患者早期miRNAs变化可以作为评价患者的病情及预后的指标之一，将为研究SAH的发病机制和临床防治提供一定的理论和实验依据。但本研究还有很多局限，由于非手术组术前药物应用较多，未收集本次试验，且收集的患者数相对较少等，需要进一步完善。

参考文献

1. Axtell MJ，Meyers BC.Revisiting criteria for plant miRNAannotation in the era of big data［J］.Plant Cell，2018，30（2）：272-284.
2. Yang L, Li C, Liang F, et al.MiRNA-155promotes proliferation by targeting caudal-type homeobox1(CDX1) in glioma cells[J].Biomed Pharmacother, 2017, 95: 1759-1764.
3. Teng Y, Miao J, Shen X, et al. The modulation of MiR-155 and MiR-23a manipulates Klebsiella pneumoniae Adhesion on Human pulmonary Epithelial cells via Integrin α5β1 Signaling[J].Sci Rep,2016,6:31918.