结肠癌患者血浆及粪便中APC基因启动子甲基化检测及其临床意义

 结肠癌患者血浆及粪便中APC基因启动子甲基化检测及其临床意义

郑其安 ,王喜

湛江市坡头区人民医院

【摘要】目的研究结肠癌患者血浆及粪便中APC基因启动子甲基化检测及其临床意义。 方法 选择我院2021年1月-2023年1月期间收入的150 例健康查体者作为对照组，以及150例诊断明确的结直肠癌患者作为研究组，留取上述两组外周血和粪便，应用甲基化特异PCR（Methylation specific PCR，MSP）对上述标本进行APC基因启动子DNA甲基化检测，判断各组标本启动子的甲基化水平。 结果150例结肠癌患者中，存在84例癌组织中检测到APC基因启动子区存在甲基化改变，剩下66例未检测出APC基因启动子区甲基化改变。150例结肠癌患者组织为阳性的患者中，有69例血浆中检测出阳性，阳性率达 46.00%；150例健康者的血浆中均没有检测到APC基因启动子甲基化阳性，其特异性为100%。43例血浆APC基因启动子甲基化阳性的肺癌患者其血浆甲基化APC浓度范围为1.61x102-6.98x102拷贝/mL，中位浓度为1.78x103拷贝/mL。 结论MSP检测血浆APC基因甲基化在结肠癌诊断中具有一定潜在意义，对患者诊断具有一定帮助。

【关键词】结肠癌；血浆；粪便；APC；甲基化检测

    结肠癌属于结肠黏膜上皮恶性肿瘤，好发于乙状结肠和直肠交界处，患者早期并无症状，进展后会出现便血、腹痛、消化不良等，但症状缺乏特异性，容易忽视[1]。结肠癌发病后较为复杂，目前主要发病因素包括高脂肪摄入过多、纤维素摄入不足，环境、遗传均为该疾病发病因素，关于这类患者的治疗主要以手术为主，但更重要的是对患者进行诊断，以便尽早开展治疗[2]。APC启动子区的高甲基化在肿瘤发生发展中起到重要作用，对肿瘤患者诊断具有重要意义，能够对患者诊断起到一定帮助[3]。本文通过将APC基因启动子甲基化检测纳入研究，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2021年1月-2023年1月期间收入的150 例健康查体者作为对照组，以及150例诊断明确的结直肠癌患者作为研究组。纳入标准[4]：①研究组患者均获得确诊；②对照组无任何癌症；③符合我院伦理委员会认可。排除标准：①无法积极配合研究者。对照组：男76例，女74例，年龄为23-74岁，平均为（51.65±5.41）岁。研究组：男74例，女74例，年龄为23-74岁，平均为（51.14±5.23）岁。上述两组入选者之间，无差异，P＞0.05，可作为本文研究对象。

1.2 方法

将收集的粪便洗脱细胞及血浆于 10ml 离心管中，于 4℃2500转/分离心10分钟，弃掉上层液体，保留管底细胞成分。用1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤管底细胞，并将其转至1.5ml离心管中，于4℃2500转/分离心10分钟，弃掉上层液体，保留管底细胞成分。重复上一步。将 1.5ml 离心管置于-80℃保存，并标记。

根据 Qiagene DNA blood minikit操作说明提取 DNA：室温下溶解样品，如果缓冲液 AL有沉淀出现，在56℃水浴下溶解，在使用缓冲液AL前摇晃几下使之充分混合。将1.2ml protase溶剂加到QIAGENE protase中溶解。缓冲液 AW1、缓冲液 AW2 是浓缩的，第一次使用前分别将适量的无水乙醇加入到瓶中。将 1.5ml 离心管中的样品定容到 200μl（若样品不到200μl可用 PBS 调整体积到200μl。将20μl蛋白酶加到1.5ml离心管中，使酶与样品充分混合。将200μl缓冲液AL加到样品中，震荡15秒使其充分混合。56℃水浴10分钟。将离心管甩干，以去除盖子上的溶液。将200μl 无水乙醇加入到样品中，震荡15秒使之充分混合，混合后将离心管甩干。将上一步的样品加入柱子中，8000 转/分离心1分钟，弃流出液，然后将柱子放入另一个 2ml 离心管中。将500μl缓冲液AW1加入到柱子中，8000转/分离心1分钟，弃流出液，然后将柱子放入另一个 2ml 离心管中。将500μl缓冲液AW2加入到柱子中，然后14000转/分离心3分钟。将柱子放入一个2ml离心管中，全速离心1分钟，将上一步中的管连同液体丢掉。将柱子放入一个1.5ml离心管中，将200μl 去离子水加入到柱子中，室温下静置1分钟，然后8000转/分离心1分钟。再取一1.5ml 离心管重复上一步，用去离子水洗脱DNA可增加DNA15%。

2 结果

2.1结肠癌组织APC基因甲基化检测结果

150例结肠癌患者中，存在84例癌组织中检测到APC基因启动子区存在甲基化改变，剩下66例未检测出APC基因启动子区甲基化改变。

2.2 CB+及NCI-H460 单个克隆细胞株APC基因甲基化的MSP鉴定

CB+和由NCI-H460细胞株单个克隆化所得到的4A11细胞经甲基化引物扩增，出现90bp产物（见图1），表明NCI-H460 APC启动子区存在甲基化。

图1 APC基因甲基化引物扩增产物的电泳图

2.3 临床血浆检测

用实时荧光定量MSP检测血浆APC基因启动子甲基化，150例结肠癌患者组织为阳性的患者中，有69例血浆中检测出阳性，阳性率达 46.00%；150例健康者的血浆中均没有检测到APC基因启动子甲基化阳性，其特异性为100%。43例血浆APC基因启动子甲基化阳性的肺癌患者其血浆甲基化APC浓度范围为1.61x102-6.98x102拷贝/mL，中位浓度为1.78x103拷贝/mL。

3 讨论

结肠癌是临床消化内科常见恶性肿瘤，主要指患者腹部结肠部位黏膜上皮组织发生癌变，持续进展后患者以大便带粘液和血、大便次数增多，引发肠梗阻症状[5]。由于患者早期缺乏典型症状，因此需要对患者采取良好的诊断方式，已有大量研究证实肿瘤患者血浆中肿瘤特异性循环DNA显著升高，这一改变可发生在肿瘤早期。检测血浆中这些抑癌基因甲基化可用于肿瘤的早期诊断[6]。目前检测DNA甲基化的技术中，最常用的是基于亚硫酸氢盐修饰的MSP技术，结果通过扩增后采用电泳进行判断。检测过程中对标本DNA进行提取和化学修饰，会有大量DNA模板丢失和降解，因此MSP仅对含大量DNA的肿瘤组织标本适用，而难以用于检测血浆DNA中微量水平的抑癌基因甲基化[7-9]。

建立高敏感性的DNA甲基化检测技术就显得尤为重要，本文通过检测结肠癌患者APC基因启动子甲基化情况，结果中150例结肠癌患者中，存在84例癌组织中检测到APC基因启动子区存在甲基化改变，剩下66例未检测出APC基因启动子区甲基化改变。150例结肠癌患者组织为阳性的患者中，有69例血浆中检测出阳性，阳性率达 46.00%；150例健康者的血浆中均没有检测到APC基因启动子甲基化阳性，其特异性为100%。43例血浆APC基因启动子甲基化阳性的肺癌患者其血浆甲基化APC浓度范围为1.61x102-6.98x102拷贝/mL，中位浓度为1.78x103拷贝/mL。结果证实了APC基因启动子甲基化检测在结肠中的意义，与健康人群对比也存在一定差异。使用本研究建立的方法，在肿瘤组织为阳性的肺癌患者的血浆中，APC基因启动子甲基化检出率为46.00%，而在健康对照组的血浆中，没有检测出一例阳性，这也证实了肿瘤患者血浆DNA主要来源于肿瘤细胞死亡释放的结论。结肠癌患者血浆的甲基化检出率与结肠癌类型中的恶性程度及是否容易产生转移有关[10]。根据推算，本法可检测出肿块直径小于1cm(1x10°个肿瘤细胞)患者的外周血甲基化改变，CT检查只能发现1 cm以上的肿块，传统 的X线检查更是只能发现2 cm以上的肿块。如此，本研究所建立的检测方法在结肠癌早期诊断方面可能具有重要的应用价值[11]。

综上所述，结肠癌患者APC基因启动子甲基化检测具有重要意义，能够对患者诊断提供一定辅助作用，值得应用。

参考文献

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[2] 袁喜先,王凤荣,陈月,等. Survivin shRNA⁃APC双基因对HT⁃29结肠癌细胞hMLH1、hMSH2表达的影响[J]. 临床内科杂志,2020,37(9):650-654.

[3] 袁禧先,张书娟,张玉健. Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌裸鼠皮下移植瘤细胞内质网通路中GRP78、 Caspase-12表达的影响[J]. 临床内科杂志,2019,36(6):415-418.

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[5] 袁喜先,张蒙蒙,曲若梅,等. Survivin shRNA-APC双基因共表达稳转株对人HT-29结肠癌细胞中PCNA、Ki-67表达的影响[J]. 中国临床研究,2019,32(5):597-599,603.

[6] 袁喜先,孙元佳,王凤荣,等. Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌HT-29细胞MCM2、Psmd10表达的影响[J]. 广东化工,2021,48(1):121-123.

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[8] 袁禧先,张蒙蒙,曹雅,等. Survivin shRNA-APC双基因共表达稳转株对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织新生血管形成的影响[J]. 中国综合临床,2018,34(3):223-227,封3.

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[10] 袁喜先,陈月. survivin shRNA-APC双基因对人HT-29结肠癌细胞中c-myc、hTERT表达的影响[J]. 广东化工,2020,47(22):53-54,40.

[11] 啜东宇,林大鹏,陈玉泽,等. XELOX新辅助化疗用于局部进展期低位直肠癌的效果及对癌基因表达的影响[J]. 疑难病杂志,2019,18(5):486-488,497. 项目信息:湛江市科技计划项目(2017B01060)